重组腺相关病毒神经肽Y基因转染对红藻氨酸致痫大鼠癫痫发作及其海马组织中Tau蛋白表达的影响

摘要

癫痫(epilepsy)是慢性脑部神经系统疾病，其特征为因脑内一群神经元过度的同步并持续的放电所致的反复性—过性痫样发作(seizure)。癫痫因其难治性及反复发作性，对人们的生活带来极大困扰。颞叶癫痫仍然是其中最常见的药物难治性神经系统疾病。大量研究表明，遗传因素在癫痫的发病机理中占有重要的地位，难治性癫痫亦与多种耐药基因有关，因此癫痫的基因研究是当前国内外癫痫研究的热点。
　　 当前国外有关癫痫治疗的研究集中在应用抗癫痫药物治疗，迷走神经刺激和外科手术治疗，虽然从治疗的方法和治疗的效果，较前已取得了一定的进步，但仍有相当一部分难治性癫痫发作不能得到有效控制的现实让国内外专家期待和寻求一种更新的解决办法。基因治疗有希望成为药物难治性癫痫患者的替代治疗。
　　 基因治疗是20世纪80年代以后发展起来的一种新的疾病治疗方式，它通过载体将正常基因或有治疗作用的基因导入靶细胞，纠正基因缺陷或合成目的蛋白，从而达到治疗疾病的效果。在用于人类基因治疗的常用病毒载体中，重组腺相关病毒（Recombinant adeno-associated virus，rAAV）载体因其无潜在致病威胁，同时能稳定地表达外源基因，宿主范围广，转染率高等优点，得到广泛应用。
　　 NPY，即神经肽酪氨酸，是由36个氨基酸组成的一种肽类物质，广泛分布于中枢神经系统及周围神经系统，在中枢神经系统中以海马内浓度最高，具有抗惊厥作用。现已经作为基因治疗癫痫大鼠的重要神经递质。Tau蛋白是一种与微管组装密切相关的含磷糖蛋白。磷酸化Tau蛋白是神经纤维受损形成的产物。
　　 本研究通过建立规范的大鼠癫痫模型，应用腺相关病毒基因转染技术，以NPY为治疗基因，以重组腺相关病毒为载体，将NPY基因转染到脑组织特定靶区（本课题组的前期实验已证明rAAV2/1-NPY-EGFP在癫痫病理状态下的脑组织中可以实现有效表达，且脑室注射途径优于海马注射途径，故本实验主要采取脑室注射途径），观察重组腺相关病毒介导人源性神经肽Y基因(rAAV2/1-hNPY-EGFP)转染对红藻氨酸(kainicacid,KA)诱导大鼠癫痫发作行为和脑电图的影响，并进一步运用Western Blotting技术来分析NPY调控癫痫发作后海马组织中磷酸化Tau蛋白的表达变化。
　　 目的:探讨重组腺相关病毒介导人源性神经肽Y基因(rAAV2/1-hNPY-EGFP)转染对红藻氨酸(kainicacid，KA)诱导大鼠癫痫发作行为、EEG及其海马磷酸化Tau蛋白的影响，以探讨其在癫痫发病机制中的作用以及NPY基因转染对慢性癫痫治疗的可能机制。
　　 方法:72只雄性Wistar大鼠，采用随机数字表法，将其随机分成3组(n=24):对照组、KA组及NPY组。参考GeorgePainos大鼠脑立体定位图谱，确定右侧海马CA3区中心点为海马区注射靶点。采用大鼠右侧海马CA3区注射KA2μl（0.4μg/μl）每3日一次，共注射5次方法建立大鼠慢性癫痫模型。NPY组向侧脑室注射10μl的rAAV2/1-NPY-EGFP（滴度为5×1011v.g./ml），KA组向侧脑室注射等量生理盐水（本研究的前期实验已证明rAAV2/1-empty-EGFP对实验结果无明显影响）。对照组在海马CA3区及侧脑室注射等量生理盐水。分别于注射后2w和4w利用视频监视系统对大鼠的行为学进行观察，了解各组大鼠颞叶癫痫发作情况及发作潜伏期，EEG癫痫波的频率和波幅，随后取材用Western blotting的方法分析大鼠海马组织中总Tau蛋白和磷酸化Tau蛋白的表达。
　　 结果:(1)行为学观察:与KA组相比，2w时NPY组大鼠行为学无明显差异(P＞0.10)，4周时NPY组大鼠行为学发作级别降低、发作潜伏期延长、脑电图癫痫波放电频率减少、波幅降低(P＜0.05)，对照组无发作;(2)免疫印迹结果:与对照组相比，KA组和NPY组大鼠在2周和4周时磷酸化Tau蛋白表达水平均明显增加(P＜0.05);与KA组相比，NPY组大鼠4w时海马组织中磷酸化Tau蛋白表达水平显著降低(P＜0.05)。
　　 结论:(1)rAAV2/1-hNPY-EGFP基因转染可以明显减轻KA诱导的大鼠癫痫发作的级别，并可延长发作的潜伏期。(2)rAAV2/1-hNPY-EGFP基因转染可能通过抑制KA诱导的大鼠癫痫发作时磷酸化Tau蛋白的表达而发挥抗癫痫作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 模型情况

2 行为学观察结果

3 脑电图结果

4 免疫印迹结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历