酚妥拉明对束缚应激大鼠海马神经元凋亡的影响

摘要

应激（stress）是指机体在遭受到强烈的躯体刺激或处于各种威胁性紧张环境下所产生的非特异性适应反应。它的反应基础主要是蓝斑—交感—肾上腺髓质轴(locuscoeruleussympatheticadrenalmedullaaxis，LC/NE)及下丘脑—垂体—肾上腺皮质轴(hypothalamicpituitaryadrenalaxis，HPA)的作用。当机体受到强烈应激时，标志轴LC/NE和HPA轴兴奋。去甲肾上腺素（norepinephrine，NE）作为调节LC/NE轴的关键因素，对机体应激时所产生的神经内分泌反应起到重要调节作用，进而影响机体的躯体健康及心理健康。
　　 海马作为应激反应的高位调节中枢，敏感且易损伤，同时，作为边缘系统的重要构成部分，参与了应激时情绪反应及行为记忆等改变。研究表明，应激可能通过增加海马神经元细胞凋亡，导致海马损害，从而诱发精神损害等一系列症状。
　　 有研究认为，中枢神经系统内存在与应激因素相关的α型肾上腺素能受体(adrenergicreceptor，AR)，但其影响海马凋亡的机制尚不清楚。
　　 目前关于细胞凋亡的发生机制，普遍认为有3条途径参与凋亡的发生发展:即线粒体途径、死亡受体途径和内质网途径。其中，内质网途径是近年来研究发现的一种新的独特的凋亡途径，该途径的核心基础是内质网应激(endoplasmicreticulumstress，ERS)及未折叠蛋白反应(unfoldedproteinresponse，UPR)。其中，GRP78是内质网应激反应的关键因子，CHOP是凋亡关键因子。因此，应激状态下，海马神经元的凋亡是否通过内质网应激途径所介导，并且α型肾上腺素能受体是否发挥了作用，尚有待实验证实。
　　 目的:本实验通过建立大鼠束缚应激模型，采用脑立体定位和微量注射技术，于束缚应激前30min侧脑室注射NE(norepinephrine)的α受体拮抗剂酚妥拉明(phentolamine)。采用TUNEL方法检测海马神经元凋亡;免疫组织化学方法检测内质网应激标志分子GRP78和CHOP蛋白的表达，以期观察酚妥拉明处理对束缚应激大鼠海马神经元凋亡及内质网应激的影响。
　　 方法:
　　 1建立大鼠束缚应激模型
　　 大鼠采取单笼独立饲养，束缚应激装置采用通风良好的圆柱形自制塑料瓶，直径7.5cm，长度（17±1）cm。以大鼠置于其中不能自由转身为宜。每日束缚8h（8:00至16:00），持续7天。束缚期间禁食禁水，其余时间自由进食、水。
　　 2建立大鼠束缚应激模型，通过脑立体定位和微量注射技术，分别于束缚应激前30min侧脑室注射NE的α受体拮抗剂酚妥拉明(phentolamine，Phen):1μg组、10μg组、100μg组。
　　 3采用TUNEL法检测海马神经元的凋亡，免疫组化方法检测内质网应激标志分子GRP78、CHOP蛋白表达的变化。
　　 用SPSS13.0软件进行统计学分析，数据用均数±标准差（(x)±s）表示。各组均数的比较行单因素方差分析(ANOVA)，用最小显著差法(leastsignificantdifference，LSD)作两两比较，P＜0.05为有显著性差异。
　　 结果:
　　 1各组大鼠体重增长变化情况:
　　 与正常对照组大鼠相比，给予大鼠束缚应激7天后，各组（单纯束缚应激、束缚应激加生理盐水组、束缚应激加酚妥拉明药物组）大鼠体重增长均减慢(p＜0.05)
　　 2TUNEL技术原位检测细胞凋亡情况:
　　 与正常对照组相比，单纯束缚应激7天组大鼠海马神经元TUNEL阳性表达明显增加(p＜0.05)。
　　 与束缚应激+侧脑室注射等量生理盐水组比较，侧脑室注射NE的α受体拮抗剂酚妥拉明:1μg组、10μg组、100μg组TUNEL阳性表达均下降(p＜0.05)。
　　 3免疫组化方法检测内质网应激标志分子GRP78、CHOP蛋白在大鼠海马区的表达:GRP78、CHOP的阳性信号均定位于胞浆，与正常对照组相比，束缚应激组大鼠海马区GRP78、CHOP表达均明显增加;侧脑室注射不同浓度的NE的α受体拮抗剂酚妥拉明后，与束缚应激同时注射生理盐水组相比，GRP78、CHOP的阳性表达均明显降低（P＜0.05）。
　　 结论:在束缚应激大鼠模型条件下，大鼠海马神经元凋亡增加，GRP78以及CHOP阳性表达增加。GRP78作为内质网应激启动因子，CHOP作为内质网应激凋亡信号通路的关键因子，提示束缚激活了内质网应激以及内质网应激相关的凋亡通路。采用NE的α受体拮抗剂酚妥拉明处理后，GRP78以及CHOP阳性表达下降表明内质网应激及凋亡有所抑制，这就提示酚妥拉明改善了大鼠海马神经元的凋亡现象，并且改善凋亡的机制可能与减轻细胞内质网应激有关。所以我们认为当机体处于应激状态下，NE通过与受体结合发挥生物学作用，启动LC/NE系统，促进海马神经元的凋亡。并且凋亡机制可能通过内质网应激实现。

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摘要

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 去甲肾上腺素在机体应激反应中的作用

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