地西他滨对多发性骨髓瘤细胞株U266、淋巴瘤细胞株Jurkat增殖凋亡影响的实验研究

摘要

目的:地西他滨(decitabine，DAC)，是一种核苷类似物，磷酸化的地西他滨参与DNA合成，然后与DNA甲基转移酶(DNMTs)共价结合，抑制DNMTs活性，从而达到DNA去甲基化，激活抑癌基因最终可起到肿瘤细胞分化或凋亡的作用。FDA已经正式批准地西他滨用于治疗骨髓增生异常综合征(MDS)。地西他滨对难治性急性髓系白血病的治疗近期也屡见报道。而地西他滨对淋巴系统肿瘤的治疗研究报道较少。
　　 国内外研究已证实淋巴瘤患者及其细胞系中存在异常的高度甲基化，经常发生于富于CpG岛的肿瘤抑制基因（如P15INK4B基因，SHP-1基因，P53基因）启动子区，并导致该基因的沉默。基础研究表明DAC能够诱导淋巴瘤细胞株Raji中P15INK4B基因去甲基化并使其表达增强，从而抑制肿瘤细胞增殖。最近研究显示，Gore和Garcia—Manero分别报道用5-氮胞苷和丁酸苯酯、地西他滨和丙戊酸（丁酸苯酯、丙戊酸为组蛋白乙酰化酶抑制剂）联合用药，对白血病和T细胞淋巴瘤患者进行一、二期临床试验时均显示出明显的协同效应。并有研究显示在体内，地西他滨能增加细胞对生物治疗的敏感性，如维甲酸，并增加凋亡因子的表达。
　　 多发性骨髓瘤(MultipleMyeloma，MM)，为发生于B淋巴细胞的恶性浆细胞病，依现在医疗水平仍未能达到治愈。T细胞淋巴瘤(T-celllymphoma)，即T细胞非霍奇金淋巴瘤(NHL)好发于亚洲地区，与B细胞来源的NHL一样具有侵袭性，是一种来源于T淋巴细胞的恶性克隆增殖性疾病，预后更差。虽T细胞NHL经常规治疗后部分患者达到缓解，但缓解期短，短期之内可出现复发或进展，目前复发或难治性T细胞NHL，尚无标准的挽救治疗方案。需寻找有效药物及其联合治疗方案以提高T细胞淋巴瘤患者疗效及改善预后。当前表观遗传学对肿瘤的治疗作用越来越受到关注，其中主要包括去甲基化治疗。
　　 为进一步探讨地西他滨对淋巴系统肿瘤细胞增殖及促凋亡的机制，本实验选用多发性骨髓瘤细胞株U266，人类T细胞淋巴瘤Jurkat细胞株，分别观察地西他滨对U266细胞株，Jurkat细胞增殖的抑制以及诱导凋亡作用及影响。
　　 此外，T淋巴细胞参与免疫应答，它们在对肿瘤细胞的杀伤以及抑制肿瘤生长中起着不可忽视的作用。T淋巴细胞可分为T辅助淋巴细胞(Th)和T杀淋巴细胞(Tc)两大类。Th1型细胞因子包括INF-α、IL-2和肿瘤坏死因子β(tumornecrosisfactor-β，TNF-β)介导细胞的免疫应答，对机体抗病毒、抗肿瘤起着重要的作用;TH2类细胞因子主要包括，IL-4、IL-6、IL-10等，可能还包括IL-9，介导体液免疫应答，与抑制自身免疫、移植物耐受、抗排斥反应有关。目前研究显示，淋巴细胞可以通过细胞因子INF-α、TNF等活化的Th和Tc细胞进行效地抑制恶性肿瘤细胞的生长，而大部分存在肿瘤的患者往往免疫功能很低下，据研究报道这主要原因是由于肿瘤细胞分泌免疫抑制因子，而抑制了T淋巴细胞的功能。地西他滨对T淋巴细胞功能的影响，目前还未见报道。Jurkat是humanT淋巴瘤细胞系，可以分泌IL4、IFN-α和IL-10，我们以Jurkat细胞为做为体外研究T细胞分化的模板，模拟地西他滨对T淋巴细胞功能的影响。检测DAC对T细胞分泌的细胞因子IL-4，IL-10及INF-α水平的影响，进而为恶性淋巴瘤患者的免疫治疗提供理论依据。
　　 方法:
　　 1、常规方法培养U266细胞株，人T细胞淋巴瘤Jurkat细胞株，每24小时传代一次。选用对数期细胞进行试验。
　　 2、CCK-8法检测不同浓度的地西他滨对U266细胞，Jurkat淋巴瘤细胞增殖的影响:首先依据查询文献，我们将DAC的浓度设置为(1、2、3、5、10、20、50、100、150、200、250、500μg/ml)分别作用于上述两种细胞进行预实验，我们分别算出作用两种细胞两药48h细胞增殖抑制50％的药物浓度(IC50)，并根据两种细胞的IC50，我们选用附近浓度得出50、100、250μg/ml作用于U266细胞;得出2、5、10μg/mL于作用Jurkat细胞。分别作用24h、48h、72h观察U266细胞及Jurkat细胞的抑制率
　　 3、AnnexinV/PI双染法检测不同浓度的地西他滨对U266细胞，Jurkat淋巴瘤细胞凋亡的影响，药物作用浓度同CCK-8实验，观察单药作用24h、48h、的凋亡率;
　　 4、应用酶联免疫分析(ELISA)实验，药物作用浓度同CCK-8实验，观察地西他滨作用48h的Jurkat淋巴瘤细胞分泌IL-4，IL-10及INF-α细胞因子的表达量变化;
　　 5、统计学分析:SPSS13.0软件进行分析，分组资料的表示用均数±标准差，两组比较应用t检验，多组比较应用单因素方差分析，P＜0.05为有差异，提示有统计学意义。
　　 结果:
　　 1、地西他滨对U266细胞增殖抑制及细胞凋亡的影响
　　 CCK-8法检测显示，不同浓度的DAC作用24h、48h、72h后的U266细胞，发现可以抑制细胞增值，增殖抑制率由23.6±0.12％增加到65.06±0.03％，呈剂量和时间的依赖性。对照组与处理组及处理组之间统计学分析，差异有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞术分析结果显示，DAC作用于U266细胞，随时间延长和药物浓度的增加，细胞凋亡率由9.7±0.74％增加到69.4±0.24％。DAC促U266细胞凋亡呈时间剂量依赖性。对照组与处理组及处理组之间统计学分析，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2、地西他滨对Jurkat细胞增殖抑制及细胞凋亡的影响
　　 CCK-8法检测显示，不同浓度的DAC作用24h、48h、72h后的U266细胞，发现可以抑制细胞增值，增殖抑制率由17.53±0.02％增加到83.63±0.57％，呈剂量和时间的依赖性。对照组与处理组及处理组之间统计学分析，差异有统计学意义(P＜0.05)。流式细胞术分析结果显示，DAC作用于Jurkat细胞，随时间延长和药物浓度的增加，细胞凋亡率由9.7±0.74％增加到69.4±0.24％。DAC促Jurkat细胞凋亡呈时间剂量依赖性。对照组与处理组及处理组之间统计学分析，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3、地西他滨对Jurkat细胞功能的影响
　　 应用酶联免疫法分析结果显示，地西他滨可诱导促进Jurkat细胞分泌细胞因子，低浓度组地西他滨可明显促进IL-4分泌，Th1/Th2比值下降，增强免疫耐受功能;中、高浓度组地西他滨可明显促进INF-α分泌，Th1/Th2比值明显上升，增强抗肿瘤功能。统计学分析显示空白对照组与处理组之间有统计学差异(P＜0.05)
　　 结论:
　　 1、地西他滨可抑制U266细胞的增殖，并促进U266细胞凋亡，呈时间和剂量依赖性。
　　 2、地西他滨可抑制Jurkat淋巴瘤细胞增殖，并促进Jurkat细胞凋亡，呈时间和剂量依赖性。
　　 3、地西他滨可促进T淋巴细胞分泌IL-4，IL-10及INF-α细胞因子，低浓度组地西他滨可使Th1/Th2比值下降，增强免疫耐受功能。中高浓度组地西他滨可使Th1/Th2比值升高，增强抗肿瘤功能。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验仪器与试剂

2 实验方法

3 统计学处理

结果

1 地西他滨对U266细胞增殖抑制及细胞凋亡的影响

2 地西他滨对Jurkat细胞增殖抑制及细胞凋亡的影响

3 地西他滨对Jurkat细胞功能的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 恶性淋巴瘤应用去甲基化药物治疗研究

致谢

个人简历