P物质对T型钙通道的调节以及T型钙通道在疼痛中的作用

摘要

T型钙通道是一类低电压（-60mV）激活钙通道，包括三个亚型:CaV3.1、CaV3.2、CaV3.3。在中枢神经中T型钙通道引发起搏点活动和低阂值神经冲动。外周神经系统T型钙通道主要存在于中小直径的DRG神经元中，且主要是CaV3.2亚型。至今发现多种疾病都与T型钙通道的功能状态异常有关，如癫痫、疼痛、心脏病、糖尿病、高血压和癌症等。T型钙通道有着重要的生理病理学意义，其分子调节机制一直是很多实验小组研究的热点。
　　 由于缺乏其特异性开放剂与阻断剂，T型钙通道分子调节机制研究进展缓慢。近几年随着其特异性开放剂与阻断剂的发现，对于T型钙通道的分子机制的研究报道越来越多，并取得了很大进展。但目前对于T型钙通道的调节机制仍有许多未明之处。了解T型钙通道的分子调节机制将为临床预防与治疗各种T型钙通道功能异常所导致的疾病提供理论支持。
　　 疼痛目前仍然是困扰人们身心健康的一大难题，给人们的正常生活带来诸多不便。离子通道与疼痛的关系早已成为人们研究的热点。研究发现，T型钙通道功能异常与各种神经性疼痛与炎性疼痛有着密切关系。但目前尚未见T型钙通道功能调节剂对疼痛行为研究的报道。
　　 研究将围绕T型钙通道功能调节机制及其在疼痛中的作用展开。
　　 第一部分.P物质对T型钙通道的调节及其分子机制的研究
　　 目的:研究P物质对T型钙通道的作用并寻找其调节作用的信号通路。包括:(1)研究P物质对表达的CaV3.2通道电流的调节作用。(2)研究P物质对DRG神经元中T型钙通道电流的调节作用。(3)寻找介导P物质对T型钙通道作用的信号转导分子。
　　 方法:利用打孔全细胞膜片钳技术进行研究。
　　 结果:
　　 (1)打孔全细胞膜片钳实验结果表明，1μMSP可显著抑制表达在HEK293细胞中CaV3.2钙电流（共表达NK-1受体），抑制率为30.2±6.8％(P＜0.05，n=13)且其抑制作用可被还原剂1mMDTT恢复至基础电流的99.3±5.7％，n=12。
　　 (2)全细胞膜片钳实验结果表明，1μMSP可显著抑制DRG神经元中T型钙电流，抑制率为25.9％±5.3％(P＜0.05，n=11)。且抑制作用可被1mMDTT恢复至基础电流的105.7±11％(n=8)。SP对高电压激活(HVA)钙通道功能无影响。
　　 (3)H2O2(300μM)可抑制过表达系统中CaV3.2钙通道电流，抑制率为9.4±1.7％(P＜0.05，n=5)。其抑制可以被DTT洗脱（电流恢复至抑制前的102.1±1.3％，n=5）。但H2O2对T型钙通道的抑制作用明显小于SP所产生的抑制作用。
　　 (4)AntimycinA(1μM)灌流给药可使表达系统中CaV3.2钙电流增大到基础电流的142.1±7.6％(P＜0.05，n=8)，但DTT不能使电流恢复至基础电流水平。
　　 (5)SP不能抑制HEK293细胞中表达的突变体CaV3.2(H191Q)（共表达NK-1受体）电流(n=8)。
　　 结论:运用电生理膜片钳手段发现SP选择性抑制T型钙通道电流，而对高电压激活钙通道无作用。
　　 这种抑制作用的信号分子可能是细胞内的ROS，其作用关键位点位于CaV3.2的191位组氨酸。
　　 第二部分.T型钙通道激动剂ST101对CaV3.2电流和疼痛行为的影响
　　 目的:观察大鼠右后脚掌注射T型钙通道开放剂ST101对动物疼痛行为的影响。具体研究(1)T型钙通道开放剂ST101对表达的CaV3.2钙电流的作用，并根据EC50确定动物痛实验中所用药物浓度。(2)ST101在自发性疼痛、热痛和机械刺痛中的作用。
　　 方法:全细胞膜片钳技术;大鼠自发性疼痛、热痛和机械刺痛模型。
　　 结果:
　　 (1)ST101可以增大过表达于HEK293细胞中的CaV3.2钙电流，其作用呈浓度依赖性，EC50为8.7±1.4nM。100nM的ST101到达最大效应，可使CaV3.2钙电流增大42.4±4.2％(n=5)。
　　 (2)整体动物行为学实验结果表明，足掌部注射ST101不能引起大鼠脚掌自发性疼痛，动物舔、抬、啃脚的总时间分别为:溶剂(saline)(25μl)，5.9±1.7s;ST101(20μM,25μl),15.3±5.1s;缓激肽(BK)(200μM,25μl)100.3±17.9s(P=0.09,n=13)。
　　 (3)在热痛与机械刺痛实验中，足掌部注射相同量的ST101也不能使动物脚掌痛觉增敏。机械刺痛阈分别为:ST101组给药前为68.4±7.9g，给药后为59.3±4.8g(P＞0.05，n=5);对照组（saline组）给药前为60±0g，给药后为53.2±6.8g(P＞0.05，n=5)。热痛实验结果为:ST101组给药前为36.3±3.2s，给药后为38.6±2.0s(P＞0.05，n=5);对照组（saline组）给药前为38.9±0.9s，给药后为38.6±0.6s(P＞0.05，n=5)。
　　 结论:本部分实验结果表明，ST101可增大过表达系统中的CaV3.2电流。但在动物痛实验中并引起大鼠自发性疼痛，也未导致热痛与机械痛痛觉增敏。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 P物质对T型钙通道的调节及其分子机制的研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 T型钙通道激动剂ST101对CaV3．2电流和疼痛行为的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 T型钙通道生理病理学功能及其分子调节机制

致谢

个人简历