姜黄素对人肝癌细胞株HepG2中p21WAF1/CIP1及p27KipI表达的影响

摘要

目的:肝细胞癌(Hepatocellularcarcinoma)位居世界恶性肿瘤发病率的第5位，每年大约有70万人死于肝癌。我国是全球肝癌发病率最高的国家，目前我国新发病人数约占全球总数的55％，死亡人数约占全球肝癌死亡人数的45％，在我国肿瘤相关死亡中仅次于肺癌，位居第2位。虽然近年来肝癌的治疗获得了突破性的进展，手术切除和肝移植以及采用多种方法综合、序贯治疗已成为治疗肝癌的重要手段。但是由于肝癌起病隐匿，进展迅速，缺乏有效的早期诊断方法，确诊时往往已到晚期或发生转移，只能采取姑息治疗，而且肝癌对放疗和化疗敏感性低。所以总体上肝癌的治疗还未取得令人满意的临床疗效。因此，迫切需要新的治疗方法及药物提高肝癌患者的生存期及生存质量。
　　 近年来研究表明姜黄素具有抗氧化、抗炎、抗凝、降脂、抗动脉粥样硬化、抗衰老消除自由基及抑制肿瘤生长等作用。作为一种具有良好发展前景的抗癌药物，成为研究的热点。近年研究表明，姜黄素在动物模型上对皮肤癌、肝细胞癌、结肠癌、肺癌、卵巢癌、乳腺癌、胃癌等多种肿瘤细胞具有明显的抑制作用，并可诱导肿瘤细胞凋亡。虽然姜黄素能够诱导多种肿瘤细胞凋亡，但是对其凋亡机制的研究甚少，作用机制不是十分明确。
　　 p21WAF1/CIP1、p27Kip1是细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂CIP/KIP家族的成员，与细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依赖性激酶(cyclin-dependentkinase，CDK)共同构成了细胞周期调控网络。他们有着相似的抑制结构域，可抑制G1期cyclin-CDK复合体和cyclinB-CDK1，通过改变CDKs催化亚单位的构型及活性而发挥抑制作用。该基因在细胞周期调控中扮演了重要角色，近来研究表明，p21WAF1/CIP1、p27Kip1在多种肿瘤包括肝癌、胃癌、乳腺癌、胆管癌、肺癌等发生和发展过程中都表现出了抑癌基因的功能，许多研究分析都显示p21WAF1/CIP1、p27Kip1高表达与肿瘤的预后密切相关。
　　 本实验通过研究姜黄素对人肝癌细胞株HepG2细胞周期的影响及对p21WAF1/CIP1、p27Kip1表达的影响，探讨姜黄素抑制肝癌HepG2细胞增殖生长的可能作用机制。
　　 方法:1常规培养人肝癌细胞株HepG2。流式细胞术(FCM)检测细胞周期的分布情况:收集不同浓度的姜黄素(0、10、20、30、40、50μmol/L)作用的肝癌细胞HepG248h及药物浓度为30μmol/L的姜黄素作用的不同时间(0h、24h、48h、72h)肝癌细胞HepG2在流式细胞仪上机检测细胞周期，应用软件进行分析;
　　 2WesternBlot法:测定不同浓度的姜黄素(0、10、20、30、40、50μmol/L)作用的肝癌细胞(HepG2)48h及药物浓度为30μmol/L的姜黄素作用的肝癌细胞(HepG2)不同时间(24h、48h、72h)后，观察姜黄素对HepG2细胞中p21WAF1/CIP1、p27Kip1蛋白表达的影响。
　　 结果:
　　 1.FCM检测结果显示经姜黄素处理的HepG2细胞，随着药物浓度的增加及作用时间的延长，HepG2细胞在G0/G1期分布明显增多，S期、G2/M期细胞比例下降，呈现G0/G1期阻滞。呈现明显的时间依赖性和剂量依赖性(P＜0.05)。
　　 2.Western-Blot方法检测不同浓度的姜黄素(10、20、30、40、50μmol/L)作用HepG2细胞48h后，与空白对照组相比各浓度组p21WAF1/CIP1蛋白表达显著高于空白对照组(P＜0.05)，随药物浓度的增加p21WAF1/CIP1蛋白表达显著上调，40、50μmol/L组组间差异不明显(P＞0.05);其余组间差异显著(P＜0.05);
　　 3Western-Blot方法检测不同浓度的姜黄素(10、20、30、40、50μmol/L)作用HepG2细胞48h后，与空白对照组相比各浓度组p27Kip1蛋白表达量显著高于空白对照组（P＜0.05），10、20μmol/L组，40、50μmol/L组组间差异不明显（P＞0.05），其余组间差异显著(P＜0.05);
　　 4Western-Blot方法测定药物浓度为30μmol/L的姜黄素作用HepG2细胞不同时间(24h、48h、72h)后，与对照组相比p21WAF1/CIP1、p27Kip1蛋白表达量显著增加（P＜0.05），随着作用时间延长，p21WAF1/CIP1、p27Kip1蛋白表达显著增加(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.姜黄素可诱导人肝癌HepG2细胞阻滞在G0/G1期。
　　 2.姜黄素可以上调人肝癌HepG2细胞中p21WAF1/CIP1、p27Kip1蛋白的表达，推测姜黄素可通过上调肝细胞癌中p21WAF1/CIP1、p27Kip1的表达来抑制肿瘤的增殖，使细胞停滞在G0/G1期，从而促进肿瘤细胞的凋亡，来达到预防和治疗的作用。

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结论

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