瑞替加滨逆转局麻药对KCNQ2/Q3通道电流的作用以及致惊厥作用的研究

摘要

第一部分:氯普鲁卡因对KCNQ2/Q3通道电流的影响以及瑞替加滨的逆转作用
　　 目的:采用细胞膜片钳技术，研究盐酸氯普鲁卡因对KCNQ2/Q3通道电流的影响，以及瑞替加滨是否可以逆转氯普鲁卡因对KCNQ2/Q3通道电流的作用。
　　 方法:以人胚胎肾（humanembryonickindeyHEK293）细胞作为表达体系，用脂质体转染KCNQ2和KCNQ3钾离子通道基因到HEK293细胞上，使细胞表达KCNQ2/Q3通道。采用全细胞膜片钳技术，按照不同的刺激程序进行电流记录，实验分为三步。
　　 首先:观察不同浓度的氯普鲁卡因在不同电压下对KCNQ2/Q3通道电流的影响。根据氯普鲁卡因的不同浓度分为4组，即0mmol/L(C0组)、1mmol/L（C1组）、10mmol/L（C2组）、100mmol/L（C3组），其中C0组作为对照组，每组观察11个样本。细胞被钳制在-80mV后分别去极化至-40mV，0mV和+40mV，最后复极化-80mV。记录不同浓度不同钳制电压下氯普鲁卡因对KCNQ2/Q3通道电流的影响。
　　 继而:观察10mmol/L氯普鲁卡因对KCNQ2/Q3通道动力学的影响。细胞被钳制在-80mV后以10mV幅度逐步增加去极化电压，至+30mV电压水平，维持1s时间后复极化到-60mV。通过外液灌流给予10mmol/L的氯普鲁卡因，0mmol/L氯普鲁卡因作为对照，每组观察5个样本。不同激活电压下所得到的去活尾电流统一标准化后经Boltzmann方程拟合，得到KCNQ2/Q3通道电流-激活电压关系曲线（即通道Ⅰ-Ⅴ曲线）。单指数方程对电流的激活段与去活段拟合，计算出KCNQ2/Q3通道激活时间常数和通道去活时间常数。
　　 第三步:观察瑞替加滨存在时100mmol/L氯普鲁卡因对KCNQ2/Q3通道电流的作用。将细胞钳制于-80mV后去极化至0mV，再复极化至-80mV，细胞外灌流液含100mmol/L氯普鲁卡因的电极外液(C100)或含10μmol/L瑞替加滨(RTG)与100mmol/L氯普鲁卡因的电极外液(C100+RTG)，0mmol/L氯普鲁卡因(C0)作为对照，每组观察5个样本，记录0mV钳制电压下KCNQ2/Q3通道电流。
　　 结果:1钳制电压在+40mV时，C1组、C2组、C3组对KCNQ2/Q3电流的抑制率分别与C0相比，有统计学差异(P＜0.05)。钳制电压在0mV时，C1组、C2组、C3组对KCNQ2/Q3电流的抑制率分别与C0相比，有统计学差异(P＜0.05)。钳制电压在-40mV时，C1组、C2组、C3组对KCNQ2/Q3电流的抑制率分别与C0相比，有统计学差异(P＜0.05)。2单指数方程对电流的激活段与去活段拟合显示，对照组在0mV下通道激活段的时间常数为(26.9±3.9)ms，给予氯普鲁卡因(10mmol/L)后延长至（36.4±4.1）ms;而-80mV下去活段电流，对照组去活时间常数(71.3±24.7)ms，给予氯普鲁卡因（10mmol/L）后缩短为（65.0±15.0）ms(n=5)。上述结果与对照组相比均具有显著性差异(P＜0.05）。3不同激活电压下所得到的去活尾电流统一标准化后经Boltzmann方程拟合，所得到KCNQ2/Q3通道电流-激活电压关系曲线（即通道Ⅰ-Ⅴ曲线）显示，电压激活曲线向去极化方向移动。氯普鲁卡因将KCNQ2/Q3通道的半数最大激活电压（V1/2）从(-36.8±1.7)mV右移至（-26.1±1.3）mV(P＜0.05)。4100mmol/L氯普鲁卡因引起的KCNQ2/Q3通道电流抑制率为(72.90±0.03)％，同时给予瑞替加滨和氯普鲁卡因后KCNQ2/Q3通道电流抑制率降为(4.90±0.05)％，两组对比有统计学意义（P＜0.05）。
　　 结论:1氯普鲁卡因呈浓度依赖性和电压依赖性抑制KCNQ2/Q3通道电流。2氯普鲁卡因对KCNQ2/Q3通道动力学的影响为:延长激活段时间常数，缩短去活时间常数;使KCNQ2/Q3通道电流激活曲线右移。3瑞替加滨逆转氯普鲁卡因对KCNQ2/Q3电流的抑制作用。
　　 第二部分:瑞替加滨对布比卡因和氯普鲁卡因致小鼠惊厥半数有效剂量和半数致死剂量的影响
　　 目的:通过探讨KCNQ2/Q3通道开放剂瑞替加滨对布比卡因和氯普鲁卡因致小鼠惊厥的半数有效剂量(ED50)和半数致死剂量(LD50)的影响，研究KCNQ2/Q3通道与局麻药毒性的关系。
　　 方法:清洁级雌性昆明种小鼠，体重20～30g。实验Ⅰ采用随机数字方法将140只小鼠随机分为两组(n=70):对照组（C组）和瑞替加滨组（R组），两组随机分为7个亚组，分别为不同剂量氯普鲁卡因组(C+L1组、C+L2组、C+L3组、C+L4组、C+L5组、C+L6组、C+L7组和R+L1组、R+L2组、R+L3组、R+L4组、R+L5组、R+L6组、R+L7组，n=10）。C组和R组腹腔注射0.9％生理盐水0.005ml/g或瑞替加滨20mg/kg，20min后腹腔内注射氯普鲁卡因。C+L1组、C+L2组、C+L3组、C+L4组、C+L5组、C+L6组、C+L7组氯普鲁卡因剂量分别为150.0、172.5、198.4、228.2、262.4、301.8、346.1mg/kg;R+L1组，R+L2组、R+L3组、R+L4组、R+L5组、R+L6组、R+L7组氯普鲁卡因剂量分别为198.4、228.2、262.4、301.8、346.1、398.0、457.7mg/kg。实验Ⅱ采用随机数字的方法将100只小鼠随机分为两组(n=50):对照组（C组）和实验组（R组）。两组随机分为4个亚组，分别为不同剂量布比卡因组(C+B1组、C+B2组、C+B3组、C+B4组、C+B5组和R+B1组、R+B2组、R+B3组、R+B4组、R+B5组，n=10)。C组和R组腹腔注射0.9％生理盐水0.005ml/g或瑞替加滨20mg/kg，20min后腹腔注射布比卡因。C+B1组、C+B2组、C+B3组、C+B4组、C+B5组布比卡因剂量分别37.8、43.5、50.0、57.5、66.1mg/kg;R+B1组、R+B2组、R+B3组、R+B4组布比卡因剂量分别为50.0、57.5、66.1、76.0、87.4mg/kg。采用Probit法计算布比卡因和氯普鲁卡因致小鼠惊厥的ED50及其95％可信区间、LD50及其95％可信区间。
　　 结果:C组氯普鲁卡因致小鼠惊厥的ED50及其95％可信区间为165.3(155.8～175.0)mg/kg，LD50及其95％可信区间为316.5(290.4～354.3)mg/kg;布比卡因致小鼠惊厥的ED50及其95％可信区间为41.1(36.7～44.5)mg/kg，LD50及其可信区间为58.9(54.7～64.4)mg/kg。R组氯普鲁卡因致小鼠惊厥的ED50及其95％可信区间为212.4(200.2～224.3)mg/kg，LD50及其95％可信区间为402.8(371.0～447.4)mg/kg;布比卡因致小鼠惊厥的ED50及其95％可信区间为51.5(45.1～56.0)mg/kg，LD50及其可信区间为77.8(71.8～84.9)mg/kg。与C组比较，R组氯普鲁卡因和布比卡因致小鼠惊厥的ED50、LD50均升高(P＜0.05)。
　　 结论:①KCNQ2/Q3通道开放剂瑞替加滨可明显提高氯普鲁卡因和布比卡因的致惊厥的ED50，降低氯普鲁卡因和布比卡因的致惊厥作用。②KCNQ2/Q3通道开放剂瑞替加滨可明显提高氯普鲁卡因和布比卡因半数致死量，降低氯普鲁卡因和布比卡因的致死率。
　　 第三部分:瑞替加滨抗左布比卡因的惊厥作用对脑电图β频段功率谱的影响
　　 目的:观察瑞替加滨在治疗左布比卡因诱发惊厥中的作用以及对惊厥家兔脑电图β频段的影响，探讨瑞替加滨对局麻药致惊厥后的作用。
　　 方法:健康新西兰雄性大白兔20只随机分成瑞替加滨组（R组）和对照组（C组），以8ml/(kg×h)的速度耳缘静脉泵入0.5％的左布比卡因，直至家兔出现强直惊厥、脑电图出现癫痫波。强直惊厥出现后立即静脉注射瑞替加滨或生理盐水作为对照。计算两组中家兔惊厥出现时所需要的左布比卡因的量，观察两组中家兔惊厥的持续时间以及家兔癫痫波的持续时间，并连续监测血氧饱和度、心率和脑电图，分析脑电图β频段功率谱的变化。
　　 结果:1两组中致家兔出现强直惊厥所需要的0.5％左布比卡因量差异无统计学意义(P＞0.05)。实验组中家兔强直持续时间和癫痫波持续时间均明显缩短(P＜0.01)。2脑电图变化与行为学表现同步。β频段:与对照组相比，实验组β频段能量百分比在处理后1～15min内显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。处理后20～30min，对照组和实验组β频段能量相比无统计学意义（P＞0.05）。与基础值相比，生理盐水组在处理后的30min内β频段能量百分比逐渐降低，但仍高于基础值，差异有统计学意义显著性(P＜0.01)。与基础值相比，瑞替加滨组β频段能量百分比在处理后1～15min内显著降低，差异有统计学意义(P＜0.01)。
　　 结论:瑞替加滨可以明显缩短左布比卡因致家兔惊厥后惊厥的持续时间，可以对抗左布比卡因诱发的惊厥行为。左布比卡因所引起的系统毒性中，瑞替加滨可以抑制中枢神经系统的活动，减少惊厥时癫痫波的发放。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 氯普鲁卡因对KCNQ2／Q3电流的作用以及瑞替加滨的逆转作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 瑞替加滨对布比卡因、氯普鲁卡因致小鼠惊厥半数有效剂量和半数致死剂量的影响

前言

材料与方法

结果

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 瑞替加滨抗左布比卡因的惊厥作用对脑电图β频段功率谱的影响

前言

材料和方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述

致谢

个人简历