胆固醇代谢相关酶Srebf2,Hmgcr,CYP51,Clusterin在ALS转基因小鼠模型脊髓中的mRNA水平变化

摘要

目的:肌萎缩侧索硬化(ALS)是运动神经元病(MND)最常见的类型。脊髓前角运动神经元，脑干后组运动神经核及锥体束均有选择性受累。ALS病理表现为脊髓和延髓上下运动神经元损害并存，疾病后期病人呼吸机无力致呼吸衰竭并发肺部感染而死亡。为了进一步深入探索ALS的发病机制，我们对经典的ALS动物模型（SOD1G93A转基因动物）进行了Microarray全基因表达谱分析，以及散发ALS病人的血清进行了质谱筛查，发现胆固醇代谢通路多个环节的酶存在异常改变。大脑占整个机体体重的2％，但大脑胆固醇占整个机体胆固醇总量的25％。胆固醇是构成细胞的重要成份之一，它分布于人体各组织中，其中在脑组织中含量最丰富。胆固醇在神经系统发育，膜运输，信号转导，突触形成以及神经元发挥正常功能都有重要作用。不同与其他系统，神经系统胆固醇多来源于自身合成，神经系统胆固醇主要由星形胶质细胞，少突胶质细胞合成，胆固醇在胶质细胞和神经元间可以运输，维持稳定状态，由于血脑屏障的存在，中枢神经系统和外周器官的胆固醇代谢相对隔离。一旦神经系统胆固醇代谢受到影响，神经元功能就会受到影响，最终导致中枢神经系统异常及显著的神经变性。神经系统胆固醇代谢异常见于多种神经变性疾病。亨廷顿病病人及动物模型中发现有血浆胆固醇水平降低，神经系统胆固醇合成减少，神经元细胞膜胆固醇增多。在阿尔兹海默病细胞及动物模型中，胆固醇水平升高可以增加脑内淀粉样蛋白，而他汀类药物可以降低淀粉样蛋白。多项研究表明ALS（肌萎缩侧索硬化）病人存在能量代谢异常，高脂血症为预后保护因素。SOD1G93A小鼠也有类似报道。本实验室SOD1G93A小鼠基因表达谱资料显示，胆固醇代谢通路异常。Srebf2，CYP51，LSS，HMG-Coas，HMG-Coar，DCRH7，lp1，ApoE，Clusterin等胆固醇代谢相关蛋白在ALS小鼠发病期较对照小鼠均有较显著的改变。
　　 本实验应用国际公认的ALS转基因模型（SOD1G93A小鼠）来研究SOD1-G93A小鼠60天及症状早期腰髓srebf2，hmgcr，CYP51以及clusterin的表达差异，进行RT-PCR实验验证表达谱结果，探索ALS疾病中脊髓胆固醇代谢的变化。
　　 方法:(1)转基因鼠的繁殖所有动物均饲养在恒温、恒湿和无菌条件的(Specificpathogenfree，SPF)环境中，喂以灭菌的SPF级颗粒型鼠类饲料。为维持B6SJL.TgN(SOD1G93A)1Gur转基因小鼠突变基因稳定下传，将B6SJLSOD1G93A/+半合子雄鼠与B6SJLF1/J半合子雌鼠交配繁殖。子代鼠经基因鉴定确定是否带有人突变SOD1G93A的基因。(2)实验分组研究对象共分为两组组:60天，症状早期(120天左右)。每个时期组选择雌性SOD1G93A小鼠及同窝野生型小鼠各3只。(3)基因芯片结果分析和筛选通过分析本实验室的转基因小鼠脊髓基因芯片数据，发现有20个胆固醇代谢相关酶有变化，其中下调的包括:Srebf2，Hmgcr，Hmgcs1，mvk,Pmvk,mvd,FDFT1,SQLE,LSS,DHCR24,CYP51,DHCR7,SC4MOL，NSDH1，SC5D，ldlr;上调的有:Ch25h，ApoE，Clusterin，Lrp1，选取srebf2，hmgcr，CYP51以及clusterin。进行RT-PCR实验验证表达谱结果。(4)Srebf2，Hmgcr,CYP51，Clusterin基因表达水平的测定用灭活RNase器械取材，取小鼠腰膨大，放入-80℃保存。采用PrimerPremier5.0设计上下游引物（跨内含子），采用Oligo7.0分析引物，确定最终引物。采用Trizol法提取总RNA，测RNA浓度。Promega反转录试剂盒进行反转录后进行上述四个基因的RT-PCR。
　　 结果:基因表达谱结果表明在症状早期小鼠脊髓中，Srebf2，Hmgcr,CYP51均降低，而Clusterin在发病小鼠脊髓中水平升高。在随后的RT-PCR实验中，与同窝对照相比，SOD1G93A转基因小鼠在60天，症状早期脊髓中Srebf2，Hmgcr,CYP51基因表达均无明显变化;而在症状早期clusterin在转基因小鼠中有明显升高。和我们的ALS病人血清蛋白组学资料一致的是，ALS病人血清内Clusterin水平升高。
　　 结论:本实验在肌萎缩侧索硬化SOD1G93A转基因小鼠模型中，发现疾病症状早期脊髓clusterinmRNA水平有基因表达上调，但其他与胆固醇代谢相关的酶mRNA水平没有明显变化。提示ALS发病中Clusterin可能在非胆固醇代谢通路上发挥作用，但并不能排除胆固醇代谢在ALS中完全没有变化。同时，Clusterin水平在ALS病人血清中水平升高，提示Clusterin可能成为ALS新型生物学标记物。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学处理

4 血清质谱分析

结果

1、SOD1 G93A小鼠的鉴定

2、神经功能检查

3、ALS小鼠脊髓Srebf2，Hmgcr，CYP51以及Clusterin变化

4、ALS病人血清中Clusterin和Clusterin前体变化

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 Clusterin生物学特征及其和相关疾病的联系

致谢

个人简历