MPTP对不同年龄快速老化小鼠黑质纹状体系统COX-2表达的影响

摘要

目的:探讨1-甲基-4-苯基-1，2，3，6-四氢吡啶(1-methyl-4-phenyl1，2，3，6tetrahydropyridine，MPTP)对不同月龄快速老化小鼠（senescence-acceleratedmouseprone8，SAMP8）急性损伤后黑质纹状体系统环氧化酶-2（cyclooxygenase-2，COX-2）的表达。进一步来研究老化及外界环境毒物对帕金森病病理反应过程的影响。
　　 方法:
　　 1.实验动物分组与模型制备
　　 选用健康雌性SAMP8小鼠3、6、10月龄各36只，随机分为:生理盐水对照组和MPTP用药组各18只，小鼠背部皮下注射MPTP(Sigma，USA)，每次14mg·kg-1（生理盐水溶），连续注射4次，每次间隔2h;对照组每次均注射等体积无菌生理盐水。每组分别于第1次注射后1、3、7d三个时间点处死，每组每个时间点6只。
　　 2.行为学检测
　　 2.1.旷场实验
　　 采用旷场实验检测各组小鼠给药后1、3、7d的自主活动水平。实验时将小鼠置于方箱的正中央，观察其5min内活动情况，记录其垂直站立次数（前肢离开地面1cm以上的次数）与水平穿格次数（三爪以上跨入邻格）。每只小鼠实验结束，用90％酒精擦拭实验装置，以免留下气味影响其它小鼠。
　　 2.2.采用滚轴实验检测其运动协调功能。
　　 用药后第1天，第3天，第7天，分别以16、20、24、28、32rpm测定受试小鼠在转轴上滑落之前停留的时间，最长测试时间为150s。记录其停留时间，并计算overallrotarodperformance(ORP)值，公式为ORP=∑((a+b)/2)xc，其中a、b分别为动物在较低和较高速度上停留的时间，c为相邻两个速度的差值。
　　 3.标本留取
　　 体积分数10％水合氯醛麻醉小鼠，从眼球取血，离心取血清;之后迅速断头取脑，在冰上剥离出中脑黑质、纹状体组织，电子天平称重，置于液氮中冷冻。血清与组织均置于-80℃保存备用。
　　 4.COX-2血清水平的检测
　　 采用双抗夹心酶联免疫法(ELISA)测定各组小鼠血清中COX-2的含量。样品及标准品均采用复孔，最终反应底物用酶标仪比色测定。以吸光度值为纵坐标，标准品浓度为横坐标，绘制出标准曲线，求出标准曲线方程(y=Ax(ˇ)2+Bx+C,A=-0.0003,B=0.0587,C=-0.1555;R=0.9990)。
　　 5.COX-2mRNA含量的检测
　　 采用半定量RT-PCR方法测定。①总RNA提取:按Trizol试剂说明书要求，采用一步法提取总RNA。采用1.5％琼脂糖凝胶电泳，紫外投射仪观察18S和28S两条RNA条带，鉴定RNA质量;分光光度计测定RNA浓度。②RT:取2μg总RNA，按逆转录试剂盒说明书要求操作，合成eDNA。20μl反应体系，反应条件为:42℃60min，70℃10min。③PCR扩增:COX-2基因上游引物为:5'-CAGCAAATCCTTGCTGTTCC-3'，下游引物为:5'-TGGGCAAAGAATGCAAACATC-3';β-actin为内参照，上游引物为:5'-TCAGGAGGAGCAATGATCTTG-3'，下游引物为:5'-TCCTCCCTGGAGAAGAGCTA-3'，扩增片段长度为302bp;反应条件为:95℃预变性2min进入循环;94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸30s，经35个循环扩增后，72℃延伸4min。④PCR产物的检测及半定量:产物经质量分数1.5％琼脂糖凝胶电泳，用凝胶成像分析系统进行光密度分析，计算COX-2条带与β-actin条带的光密度比值，并以此作为COX-2mRNA的相对表达量，分析其表达水平的变化。
　　 6.统计学处理
　　 采用SPSS13.0软件对各组数据进行统计学处理，实验数据以(x)±s表示，各组间差异比较应用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较使用SNK(Student-Newman-Keuls)检验，以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　 结果:
　　 1.行为学结果
　　 1.1.一般行为学表现及动物死亡情况
　　 所有用药组小鼠在接受MPTP注射总量达28mg·kg-1后，开始出现竖毛、尾僵直、细小震颤等急性中毒症状，最后一次注射后小鼠出现步态蹒跚、活动减少、运动变慢等症状，以10月龄小鼠表现最为明显。用药1d后上述症状基本消失，但动作仍少。用药组6月龄小鼠死亡1只，10月龄小鼠死亡2只，3月龄小鼠无死亡。
　　 1.2.旷场实验结果
　　 与对照组相比，用药组小鼠水平穿格次数与垂直站立次数均显著减少（P＜0.01）;与3、6月龄小鼠相比，10月龄小鼠在第1、3、7d次数下降更明显，尤其是垂直站立次数，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　 1.3.滚轴实验结果与对照组相比，用药组小鼠在第1、3、7d转轴上停留时间及ORP值均显著减少，尤其注射MPTP后第1d，之后逐渐恢复，但仍然少于对照组（P＜0.01）;与3、6月龄小鼠相比，10月龄小鼠各个时间点下降均最明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 2.COX-2表达结果
　　 2.1.ELISA结果显示:与对照组相比，用药组小鼠COX-2表达从第1d开始即明显增高，并在第3d出现高峰，之后第7d略有下降（P＜0.05);与3、6月龄小鼠相比，各时间点10月龄小鼠COX-2表达水平升高最明显，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 3.COX-2mRNA的表达
　　 2.2.凝胶图像分析显示:不同月龄正常对照组的COX-2表达无明显差异（P＞0.05）;用药组小鼠COX-2表达从第1d开始即明显增高，并在第3d出现高峰，之后第7d出现回落，但仍高于对照组;在第1、3、7d，10月龄小鼠COX-2表达水平升高最明显，与3、6月龄相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　 结论:
　　 1.老化是影响帕金森病的重要因素，与环境毒素起到了协同作用。
　　 2.COX-2参与了MPTP所致帕金森病模型早期急性损伤后的病理反应过程，并随PD发展呈动态改变。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 实验方法

结果

1 行为学结果

2 COX-2的血清学表达

3 COX-2 mRNA的表达

附图

讨论

1 帕金森病模型的建立

2 关于选用快速老化SAMP8小鼠

3 行为学实验分析

4 关于COX-2

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历