扶正化瘀复方调控IκB激酶-β对非酒精性脂肪性肝纤维化作用的研究

摘要

目的:非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholicfattyliverdisease，NAFLD)疾病谱包括非酒精性单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholicsteatohepatitis，NASH)、非酒精性脂肪性肝纤维化、肝硬化和肝细胞癌。非酒精性脂肪性肝纤维化是NASH相关肝硬化发生的必经阶段，但其发病机制尚未明确，亦缺乏特异治疗方法，因此寻求一种有效的药物阻止乃至逆转非酒精性脂肪性肝纤维化成为当前研究的热点。扶正化瘀复方是在肝纤维化的基本病机“正虚血瘀”基础上研制成的传统中药复方，由丹参、绞股蓝、桃仁、松花粉、虫草菌丝、五味子六味中草药组方。我们前期研究发现，扶正化瘀复方(FuzhengHuayurecipe，FZHY)可通过抑制转化生长因子-β1(transforminggrowthfactor-β1，TGF-β1)通路相关基因的异常表达阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的发生与进展。IκB激酶-β(inhibitorκBkinase-β，IKK-β)作为核因子-κB(NuclearFactor-κB，NF-κB)上游始动信号，可促进多种转位相关基因的表达，目前尚缺乏IKK-β在非酒精性脂肪性肝纤维化发生发展中的作用及靶向调控治疗机制的研究。本研究采用高脂、胆碱-蛋氨酸缺乏(methionineandcholinedeficient，MCD)饮食建立小鼠非酒精性脂肪性肝纤维化模型，扶正化瘀复方或联合血红素氧合酶-1(hemeoxygenase-1，HO-1)激动剂血晶素(hemin)进行干预实验，观察肝组织IKK-β及其调控的效应因子单核细胞趋化蛋白-1（monocytechemoattractantprotein-1，MCP-1）、基质金属蛋白酶-2(matrixmetalloproteinase-2，MMP-2)和结缔组织生长因子(connectivetissuegrowthfactor，CTGF)mRNA和蛋白的表达变化及对疾病进展的影响，明确IKK-β在非酒精性脂肪性肝纤维化发病中的作用，进一步阐明FZHY阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的机制，为临床有效治疗NAFLD提供理论依据。
　　 方法:采用MCD饲料喂养健康雄性C57BL/6J小鼠8周建立非酒精性脂肪性肝纤维化模型，分别给予扶正化瘀复方、血晶素或扶正化瘀复方联合血晶素进行干预实验，以胆碱-蛋氨酸充足饲料设立对照组。观察实验动物毛发、活动情况及体重变化;肝组织切片采用苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色观察肝组织脂肪变、炎症活动;Masson染色观察肝脏纤维化程度;逆转录聚合酶链反应(reversetranscription-polymerasechainreaction,RT-PCR)检测IKK-β、MCP-1、MMP-2及CTGFmRNA的表达情况;Westernblot和免疫组织化学染色方法检测IKK-β、MCP-1、MMP-2及CTGF蛋白的表达情况。
　　 结果:
　　 1、实验动物一般情况:对照组小鼠毛发有光泽，活泼好动，体重随造模时间逐渐增加;模型组毛发紊乱、无光泽，活动少，精神萎靡，体重明显减轻;扶正化瘀复方组、血晶素组及扶正化瘀复方联合血晶素组小鼠毛发略显紊乱，较黯淡，精神较为呆滞，活动较少，摄食少、体重减轻。
　　 2、实验动物肝脏解剖及病理学变化:肉眼观察:对照组小鼠肝脏为暗红色，明亮有光泽，质地柔软有弹性。模型组小鼠肝脏体积明显减小，与周围组织有粘连，边缘锐利，颜色浅黄，无光泽，切面油腻，质地较硬，弹性差。扶正化瘀复方组、血晶素组及扶正化瘀复方联合血晶素组小鼠肝脏体积亦减小，呈红褐色，有光泽。光镜下观察:对照组小鼠肝组织结构基本完整，肝小叶结构正常，肝细胞排列成肝索，围绕中央静脉呈放射状分布;模型组小鼠多数肝细胞呈现大泡性脂肪变，以腺泡3带为著，小叶内可见以单核细胞、淋巴细胞为主的炎症细胞浸润，伴有点、灶状肝细胞坏死，肝窦间隙变窄，可见窦周纤维化及汇管区纤维组织增生(NAS评分7～8S3～4);扶正化瘀复方组、血晶素组肝细胞脂肪变、炎症及纤维化程度较模型组均明显减轻(NAS评分5～6S1～2)，尤以扶正化瘀复方联合血晶素组改善最显著(NAS评分4～5S0～1)。
　　 3、实验动物肝组织IKK-β、MCP-1、MMP-2、CTGFmRNA和蛋白表达:模型组IKK-βmRNA和蛋白表达显著高于对照组，应用扶正化瘀复方、血晶素或扶正化瘀复方联合血晶素干预后，小鼠肝组织IKK-βmRNA和蛋白表达明显降低，伴随炎症因子MCP-1和促纤维化因子MMP-2、CTGF的表达下调，尤以扶正化瘀复方联合血晶素组下降最明显。
　　 结论
　　 1、IKK-β及其下游效应因子MCP-1、MMP-2、CTGF在MCD饮食诱导的非酒精性脂肪性肝纤维化的发生发展中起着重要作用。
　　 2、扶正化瘀复方通过抑制IKK-β及其下游效应因子的表达阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的进展。
　　 3、扶正化瘀复方与HO-1激动剂联合应用能够协同抑制促炎、促纤维化因子表达，可更有效地阻止非酒精性脂肪性肝纤维化的发生与进展。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 实验动物一般情况

2 肝脏大体解剖

3 肝组织病理学变化

4 RT-PCR检测结果

5 Western blot检测结果

6 肝组织MCP-1免疫组织化学染色结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 非酒精性脂肪性肝纤维化分子生物学发病机制的研究进展

致谢

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