p38丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)调节P19诱导分化的多功能细胞的起搏离子通道

摘要

目的:在哺乳动物胚胎分化过程中，心血管系统形态形成开始于人类妊娠期的第20天和老鼠妊娠期第7.5天，并伴随单管状心脏的形成和自发性搏动的产生。心脏特定的基因表达所触发特定收缩蛋白和心脏分化早期离子通道蛋白的产生。最近，已经证明心脏基因的表达受胚胎心脏分化中几种特定的转录因子所调节。Csx/Nkx2.5，GATA4和MEF2C被认为是心脏形成早期起着关键性作用的心脏特定转录因子，同时也是心脏感应信号区别于其他组织或胚层有效的分子标记。
　　 同源框基因Csx/Nkx2.5脊椎动物同系的果蝇，是中胚层引起心肌层已知最早的标记之一，并且在整个心肌在心脏完全形成过程中持续性表达。GATA4是心脏特定GATA4家族的成员中的锌指转录因子，能早期识别心脏基因区域并随之在心脏形成中持续表达。MEF2C属于MADS-box基因中MEF2家族，在老鼠整个胚胎形成中表达，调控心脏形态的形成和心肌产生。细胞增殖因子的刺激下，包括BMP，ET-1和CT-1，心肌细胞分化产生是由细胞核内的转录因子活化产生，例如Csx/Nkx2.5，GATA4和MEF2C。然而，在胚胎形成的早期阶段，信号传导系统从细胞膜受体信号到核内的转录因子，然后激活心脏特定蛋白包括离子通道表达，这一点鲜为人知。换句话说，MAPK通路，ERK1/2，ERK5，JNK和p38家族，是细胞外信号传入细胞内反应的主要的信号系统。众所周知，MAPK在心肌细胞分化和心脏形态形成过程中起着关键性作用。
　　 尽管目前已知心脏基因分化早期的几种转录因子，但是对负责细胞自律性的上游信号调节转录因子很大程度上还是未知的。本研究目的在于阐明心脏基因分化的早期阶段，转录因子在P19诱导的心肌细胞对心脏起搏离子通道表达的作用，并且证明这些转录因子是通过有丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)级联信号通路调节。
　　 方法:本研究通过使用二甲基亚砜(Me2SO)将P19细胞诱导分化成心肌细胞和负责起搏电位的3种细胞膜离子通道电流，L-型钙离子通道电流(ICa.L)，T-型钙离子通道电流(ICa.T)，和超极化激活内向离子通道电流(If)，并通过RT-PCR，蛋白印迹(Westernblot)，和Patch-clamp方法进行测定。三种MAPK总家族，p38，JNK和ERK1/2，5，使用PD98059，SP600125和SB203580抑制剂检测它们对离子通道的转录调节。
　　 结果:在P19诱导的多功能干细胞的心脏基因分化早期阶段，三种转录因子，Csx/Nkx2.5，GATA4和MEF2C，被认为是心脏发育的最初标记，早在自发性搏动的第10天之前，细胞分化的第7天已全部高度表达。p38MAPK抑制剂SB203580存在时，P19诱导的心肌细胞的自发性搏动和三种起搏离子通道的表达被抑制。p38MAPK以不同的方式直接抑制转录因子Csx/Nkx2.5和GATA4，而并不是MEF2C;除了磷酸化的GATA4，其他转录因子的表达均被p38MAPK抑制而减少。换句话说，在ERK1/2，5抑制剂PD98059或JNKMAPK抑制剂SP600125存在时，P19细胞成功地分化为自发性搏动同时表达三种起搏离子通道的心肌细胞。
　　 结论:本研究证明细胞自律性的获得和起搏离子通道的表达受转录因子Csx/Nkx2.5和GATA4调节，并通过细胞内的信号传导，在P19诱导的多能干细胞分化为心肌细胞过程中是通过p38MAPK信号通路传导。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 细胞准备

2 试验溶液和化学药品

3 全细胞膜片钳记录电流

4 实时定量RT-PCR

5 蛋白印迹分析

6 数据分析

结果

1 P19诱导分化细胞的动作电位

2 分化的P19细胞的起搏通道电流的电生理参数

3 分化的P19细胞中转录因子的改变

4 分化的P19细胞中p38蛋白改变

5 依赖p38表达的Csx／Nkx2．5和GATA4

附图

附表

讨论

1 MAPK通路在心肌细胞分化中的作用

2 Csx／Nkx2．5和GATA4之间可能的关系

3 MAPK不受影响的MEF2C活化作用

4 P38 MAPK调节GATA4的表达

5 P38 MAPK在心血管疾病中的作用

结论

参考文献

综述 干细胞移植治疗心律失常的进展与挑战

致谢

个人简历