半相合基因效应性T淋巴细胞治疗宫颈癌的小鼠模型研究

摘要

目的:本实验以小鼠宫颈癌U14细胞接种C57BL/6雌鼠，建立小鼠宫颈癌移植瘤模型。体外培养C57BL/6雌鼠及半相合基因鼠CB6F1(BABL/C×C57BL/6的杂交子一代，雌性)来源的效应性T淋巴细胞，作用于荷瘤C57BL/6雌鼠，检测其对小鼠瘤组织中的STAT3、P-STAT3、TGF-β1、IFN-γ表达的影响，观察各组小鼠生存期、GVHR的严重程度。
　　 探讨同源基因或半相合基因效应性T淋巴细胞过继免疫治疗的抗瘤效果，为临床宫颈癌的治疗提供新思路。
　　 方法:
　　 1、体外培养小鼠宫颈癌U14细胞，建立C57BL/6小鼠宫颈癌移植瘤模型。
　　 2、肿瘤抗原致敏的成熟DC制备:将C57BL/6、CB6F1小鼠骨髓细胞，体外加入rmGM-CSF、rmIL-4、肿瘤抗原裂解液，LPS诱导培养即可得到肿瘤抗原致敏的成熟DC。流式细胞仪分析其CD11c+、MHCⅡ+、CD86+细胞表面分子表达情况。
　　 3、效应性T细胞的制备:将C57BL/6、CB6F1小鼠脾细胞，经淋巴分离液分离获得淋巴细胞，尼龙毛柱吸附法收集T淋巴细胞。培养T淋巴细胞2天后，加入肿瘤抗原致敏的成熟DC，培养5天，即可得到效应性T细胞。
　　 4、LDH法效应性T细胞体外杀伤实验:将C57BL/6、CB6F1效应性T细胞与宫颈癌U14细胞以50∶1、25∶1比例混合，混合酬、时后，酶标仪检测培养液上清中LDH含量，计算效应性T细胞对肿瘤细胞的杀伤率。
　　 5、实验动物分组及治疗:将荷瘤小鼠C57BL/6完全随机分至3组，每组8只。PBS组（A组）:0.5mlPBS鼠尾静脉注射，每5天1次，共注射3次;同源基因效应性T细胞组（B组）:1×106个/0.5mlC57BL/6来源效应性T细胞鼠尾静脉注射，每5天1次，共注射3次;半相合基因效应性T细胞组（C组）:1×106个/0.5mlCB6F1来源效应性T细胞鼠尾静脉注射，每5天1次，共注射3次。观察各组小鼠生存期。
　　 6、免疫组化SP法检测荷瘤小鼠C57BL/6肿瘤组织STAT3、P-STAT3、TGF-β1、IFN-γ表达情况，采用图像分析软件对免疫组化结果进行分析，用阳性细胞百分比表示其含量。
　　 7、HE染色观察各组小鼠瘤组织坏死情况、肝及小肠的病理改变。
　　 结果:
　　 1、背部皮下接种1×106U14细胞的C57BL/6小鼠，约7天后肉眼可见接种部位肿块直径达0.5cm。
　　 2、肿瘤抗原致敏的成熟DC:细胞培养7天后，大部分悬浮生长，成簇明显，细胞表面可见毛刺状突起。流式细胞仪分析其CD11c+MHCⅡ+细胞纯度为92.4％，CD11c+CD86+细胞纯度为88.8％。
　　 3、LDH法效应性T细胞体外杀伤实验:效靶比为50∶1条件下C57BL/6、CB6F1效应性T细胞对U14细胞杀伤率差异无统计学意义(P＞0.05);效靶比25∶1条件下C57BL/6、CB6F1效应性T细胞对U14细胞杀伤率差异无统计学意义（P＞0.05）。
　　 4、各组老鼠生存期:A组B组、A组C组小鼠生存期差异有统计学意义(P＜0.05)，B组C组小鼠生存期差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 5、C57BL/6小鼠瘤组织免疫组化结果:A组和C组小鼠相比，瘤组织中STAT3、P-STAT3、TGF-β1、IFN-γ表达量差异有统计学意义(P＜0.05)。A组和B组小鼠相比，瘤组织中P-STAT3、TGF-β1表达量差异有统计学意义(P＜0.05);瘤组织中STAT3、IFN-γ表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。B组和C组小鼠相比，瘤组织中P-STAT3、TGF-β1、IFN-γ表达量差异有统计学意义（P＜0.05）;瘤组织中STAT3表达量差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　 6、HE染色结果:HE染色观察各种小鼠瘤组织，B组和C组小鼠瘤组织较A组小鼠瘤组织坏死面积大。各组小鼠肝及小肠未见明显病理变化。
　　 结论:
　　 1、在体外实验中，CB6F1来源的效应性T细胞与C57BL/6来源的效应性T细胞都能够杀伤小鼠宫颈癌U14细胞，且两者杀伤率未见统计学差异。
　　 2、C57BL/6来源的效应性T细胞过继免疫治疗，拮抗TGF-β1表达，P-STAT3低表达。
　　 3、CB6F1来源的效应性T细胞过继免疫治疗，除拮抗TGF-β1表达、P-STAT3低表达外，STAT3低表达、IFN-γ高表达。
　　 4、C57BL/6、CB6F1来源的效应性T细胞作用于荷瘤C57BL/6小鼠未见明显GVHR。
　　 5、CB6F1来源的效应性T细胞过继免疫治疗与C57BL/6来源的效应性T细胞过继免疫治疗都能够延长荷瘤C57BL/6小鼠的生存期，且两者生存期未见统计学差异。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

结果

1 背部皮下接种1×106U14细胞的C57BL／6小鼠，约7天后肉眼可见在小鼠背部肿瘤接种部位肿块直径达0．5cm

2 肿瘤抗原致敏的成熟DC

3 LDH法效应性T细胞体外杀伤实验

4 各组荷瘤老鼠生存期

5 免疫组化结果

6 HE染色结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历