氯法拉滨联合硼替佐米对白血病细胞株K562细胞增殖与凋亡影响的实验研究

摘要

目的:白血病是一种发生在造血干细胞的恶性骨髓增殖性疾病，分为急性白血病与慢性白血病。其中慢性粒细胞白血病(chronic myelogenous leuke-mia，CML)占成人白血病的15％～20％，病程发展较慢。近年来，随着分子生物及细胞遗传学等学科的快速发展，使得人们对CML的发病机制有了更深入的认识，并在此基础上探索出了许多新的治疗方法。
　　 氯法拉滨是第二代嘌呤核苷类衍生物，FDA已批准用于治疗儿童难治性或复发性ALL，是近10年来首个FDA批准专门用于治疗儿童白血病的新药，该药使部分患儿的疾病得到了持续的缓解并且使患者得到接受骨髓移植的机会成为可能。同时该药在复发或难治性AML的患儿中也显示出希望。临床研究表明该药具有广谱抗肿瘤特性，在儿童和成人的ALL，AML，MDS和CML中，均获得了满意的治疗效果。
　　 硼替佐米是一种蛋白酶体抑制剂，前期研究已经证实硼替佐米对K562细胞系有抑制增殖，诱导其凋亡的作用，并且可增强细胞中SHIP基因的表达水平。研究显示硼替佐米在体外对多种恶性肿瘤细胞株均有一定的抑制作用，该药与许多药物合用呈现协同或增敏作用，而不是单纯的相加作用[32]。
　　 SHIP基因属于肌醇5’磷酸酶家族，其主要功能是抑制PI3K/Akt通路，使细胞发生程序性死亡。本课题前期研究已证明白血病细胞K562中SHIP基因表达缺失，该基因可抑制K562细胞增殖，诱导K562细胞凋亡。
　　 目前有关氯法拉滨对K562细胞抑制增殖的研究报道尚少，为进一步明确氯法拉滨抑制K562细胞增殖及促凋亡的确切机制，本实验拟采用氯法拉滨单独或联合硼替佐米作用于K562细胞，观察其对K562细胞增殖抑制、诱导凋亡的影响，同时了解经氯法拉滨单药和联合硼替佐米处理后，K562细胞中SHIP基因表达水平的变化及其作用，为慢性粒细胞白血病的治疗提供理论依据。
　　 方法:
　　 1、CCK8检测不同浓度的氯法拉滨单药及联合硼替佐米对K562细胞增殖的影响;
　　 2、流式细胞分析法分别检测氯法拉滨单药和联合硼替佐米对K562细胞凋亡的影响;
　　 3、RQ-PCR检测氯法拉滨单药和联合硼替佐米作用于K562细胞后，SHIPmRNA的表达变化;
　　 4、统计学处理。
　　 结果:
　　 1、氯法拉滨抑制K562细胞增殖
　　 用不同浓度的氯法拉滨作用于K562细胞24h后，发现在相同的时间内，氯法拉滨在一定的药物浓度范围内，抑制K562细胞增殖呈剂量依赖性。当氯法拉滨单药作用于K562细胞系时，随着药物浓度增加，细胞增殖抑制率逐渐增高。
　　 2、氯法拉滨单药对K562细胞的促凋亡作用
　　 在氯法拉滨单药组中，在相同的时间内，随着浓度的增加，K562细胞增殖受抑，凋亡率增加。
　　 3、氯法拉滨联合硼替佐米对K562细胞的增殖抑制和促凋亡作用
　　 硼替佐米(10nmol/L)和氯法拉滨联合作用于K562细胞，抑制作用均明显增强。与单独用药相比，干预时间相同，随着药物浓度增加，抑制率明显增加(P＜0.05)，按金正均公式计算，对两种药物合用是否有协同或拮抗作用进行评价，结果提示两药联合具有协同作用。在相同的时间内，三种联合用药的细胞凋亡率随药物浓度的增加而升高，并且与单药组比较有统计学差异(P＜0.05)，说明硼替佐米和氯法拉滨联用在K562细胞上时，可产生增强效应。联合用药组分别高于相同时间氯法拉滨单药组的凋亡率，两药联合具有协同促凋亡作用。
　　 4、K562细胞中SHIP基因的表达变化
　　 经氯法拉滨单药或联合硼替佐米后，K562细胞中SHIP基因的平均表达水平增加，并且随着药物作用浓度增加而升高;且药物联合组中的基因表达水平高于单药组处理的基因表达量，两组比较具有统计学意义(P＜0.05)。药物处理组与未处理组基因平均表达水平相比，均有统计学意义(P＜0.05)，并且K562细胞中SHIP基因的表达变化与药物浓度呈现量效关系。
　　 结论:氯法拉滨或硼替佐米均可抑制K562细胞增殖，诱导其凋亡，呈剂量依赖性。两药联合具有协同作用。同时，氯法拉滨可增强K562细胞内SHIP基因的表达水平硼替佐米可增强此作用，SHIP基因可能在氯法拉滨和硼替佐米抑制K562细胞增殖，诱导其凋亡发挥一定的作用。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 研究方法

3 统计学处理

结果

1 氯法拉滨抑制K562细胞增殖

2 氯法拉滨对K562细胞的促凋亡作用

3 氯法拉滨联合硼替佐米对K562细胞的增殖抑制和促凋亡作用

4 氯法拉滨或硼替佐米对K562细胞中SHIP基因的影响

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历