吗啡依赖、戒断大鼠不同脑区肌动蛋白重构及其机制研究

摘要

目的:阿片类药物都有滥用并最终发展到成瘾的共同重要特征。目前大量研究表明反复使用成瘾药物可引起与情感动机，奖赏和学习有关的脑区神经元树突棘的结构产生持久改变，提示成瘾药物诱导突触联系发生了可塑性变化。在树突棘可塑性变化以及神经元形态的改变过程中，骨架肌动蛋白发挥着重要的作用。在骨架肌动蛋白的重构过程中，吗啡发挥着怎样的作用及其作用机理目前尚未阐明。本实验从骨架肌动蛋白入手，结合整体动物行为学、分子细胞生物学等方法，深入的研究吗啡成瘾及戒断对大鼠骨架肌动蛋白重构产生的影响，进一步深化了对阿片类药物成瘾的分子生物学机制的认识。
　　 方法:
　　 1、急性吗啡处理大鼠模型制备:健康SD雄性大鼠9只，体重(200±20g)，按随机分组原则分为对照组，吗啡45分钟组，吗啡2小时组，每组3只。对照组腹腔注射生理盐水，吗啡组腹腔注射吗啡剂量均为10mg.kg-1。吗啡45分钟组在给药后第45分钟断头取脑，2小时组2小时时断头，对照组在相应时间取脑，分离相关脑区。
　　 2、脑室内注射y-27632模型制备:根据急性处理结果显示，腹腔注射吗啡在45min时变化最为显著，故阻断时间为45min。脑室内注射阻断剂y-276320.5mg.kg-1，10min后腹腔注射吗啡10mg.kg-1，45min后断头取脑，分离相关脑区。
　　 3、吗啡成瘾大鼠模型制备:健康SD雄性大鼠24只，体重(200±20g)。按随机分组原则分为A吗啡依赖组，B吗啡依赖对照组，C吗啡戒断组，D吗啡戒断对照组，每组6只。吗啡依赖组及吗啡戒断组采用剂量递增法腹腔注射盐酸吗啡建立吗啡依赖模型，每日2次，连续7d，日剂量按5、10、15、20、25、30、35mg.kg-1逐日递增，对照组给予等体积的生理盐水。第8日，AB两组直接断头取脑，分离相关脑区，CD两组注射纳洛酮5mg.kg-1，在注射后30min内观察戒断反应并记录，观察完成后立即断头取脑分离相关脑区。
　　 4、大鼠脑室内注射模型制备:健康SD雄性大鼠12只，体重(200±20g)，按照随机分组对照原则分为A对照组，BMK-801组，CFK-506组，D小分子肽MN-16(P)(MASPGVAVSDGVIKVFN)组，每组3只。分别利用鼠立体定位系统在侧右脑室内埋入给药套管。给药时A，B，C，D组分别于脑室内注射生理盐水5μL、MK-8010.5mg.kg-1、FK-5060.05mg.kg-1、MASPGVAVSDGVIKVFN0.5mg.kg-1，脑室注射10min后采用剂量递增法腹腔注射盐酸吗啡，每日2次，连续7d，日剂量按5、10、15、20、25、30、35mg.kg-1逐日递增，第8日断头取脑，分离相关脑区。
　　 5、Western-blot的方法检测组织中肌动蛋白及其结合蛋白的水平。成瘾相关脑区组织匀浆提取总蛋白，测定其中cofilin、P-cofilin、P-LIMK、LIMK、SSH、drebrinA/E、cortactin以及β-actin。根据G-actin属于胞浆可溶性蛋白，F-actin为细胞骨架相关蛋白，采用不同缓冲液对这两种蛋白进行分步提取，分别检测其中drebrinA/E、cortactin以及G-actin、F-actin的表达，分析吗啡对drebrinA/E、cortactin转位的影响。
　　 6、免疫组化:吗啡成瘾大鼠以及脑室内注射模型大鼠固定切片，兔抗鼠P-cofilin(1∶100),drebrinA/E(1∶100)、cortactin(1∶100)孵育，DAB显色，苏木素复染后光学显微镜下观察各种蛋白表达位置及量的不同。
　　 结果:
　　 1、急性处理结果
　　 1.1、F-actin与G-actin的比值变化:与对照组相比45min组海马区下调20％;2h组无显著性变化;注射y-27632组皮质上调15％。
　　 1.2、Drebrin的变化
　　 1.2.1、前额叶皮质中的变化:45min组与2h组均无显著性变化;注射组总蛋白中drebrin表达下调25％、与F-actin结合drebrin上调30％、游离drebrin下调15％、结合游离比例上调15％。
　　 1.2.2、海马中的变化:45min组与2h组均无显著性变化;注射组总蛋白中drebrin表达上调20％、游离drebrin下调20％、结合游离比例上调35％。
　　 1.2.3、纹状体中变化:45min组总蛋白中drebrin表达下调20％、游离drebrin下调15％、结合游离比例下调20％;2h组均无显著性变化;注射组总蛋白中drebrin表达上调45％、结合游离比例上调50％。
　　 1.2.4、杏仁核中变化:45min组总蛋白中drebrin表达上调25％、与F-actin结合drebrin上调15％、结合游离比例上调30％。2h组均无显著性变化;注射组总蛋白中drebrin表达上调35％、与F-actin结合drebrin上调25％、结合游离比例上调15％。
　　 1.3、Cortactin的变化
　　 1.3.1、前额叶皮质中的变化:45min组游离cortactin下调20％;2h组均无显著性变化;注射组总蛋白中cortactin表达下调40％、与F-actin结合cortactin下调25％、游离drebrin上调20％，结合游离比例下调50％。
　　 1.3.2、海马中的变化:45min组总蛋白中cortactin表达上调20％、与F-actin结合cortactin上调25％、游离cortactin上调15％、结合游离比例下调20％;2h组总蛋白中cortactin表达上调30％、与F-actin结合cortactin上调45％;注射组总蛋白中cortactin表达下调30％、与F-actin结合cortactin下调30％、游离cortactin上调25％，结合游离比例下调40％。
　　 1.3.3、纹状体中变化:与对照组相比三组均无显著性变化。
　　 1.3.4、杏仁核中变化:45min组总蛋白中cortactin表达上调25％、结合游离比例上调15％;2h组均无显著性变化;注射组总蛋白中drebrin表达下调15％、游离cortactin下调20％，结合游离比例上调15％。
　　 1.4、Cofilin的变化:45min组在海马区上调15％;2h组在纹状体、杏仁核中分别下调15％、25％;注射组在皮质与海马区分别下调30％和40％。
　　 1.5、P-cofilin与cofilin比值的变化:45min组在皮质和纹状体中均下调15％;2h组在皮质和纹状体中分别上调25％、15％;注射组在皮质、纹状体和杏仁核中分别上调40％、25％和45％。
　　 1.6、Slingshot的变化:45min组均无显著性变化;注射组在皮质、纹状体、杏仁核分别下调30％、25％和15％。
　　 1.7、LIMK的变化:45min组在海马上调15％，纹状体下调20％;注射组皮质下调35％，海马上调50％。
　　 1.8、P-LIMK与LIMK比值的变化:注射组皮质上调20％，杏仁核下调15％。
　　 2、慢性处理结果
　　 2.1、纳洛酮戒断行为学结果:成瘾组戒断反应与对照组相比评分显著增高。
　　 2.2、Westernblot以及免疫组织化学结果
　　 2.2.1、F-actin与G-actin比例的变化
　　 2.2.1.1、前额叶皮质中变化:吗啡依赖组表达比例上调25％，吗啡戒断组比例上调75％，MK801组上调20％。
　　 2.2.1.2、海马中变化:吗啡依赖组表达比例上调30％，小分子肽组上调20％。
　　 2.2.1.3、纹状体中变化:吗啡依赖组表达比例上调170％，吗啡戒断组表达比例上调130％，MK801组上调90％，FK506组上调40％，小分子肽组上调170％。
　　 2.2.1.4、杏仁核中变化:吗啡依赖组表达比例上调35％，MK801组上调20％，小分子肽组上调30％。
　　 2.2.2、Drebrin的变化
　　 2.2.2.1、前额叶皮质中的变化
　　 2.2.2.1.1、总蛋白中drebrin的变化:吗啡依赖组表达下调30％，吗啡戒断组下调35％，MK801组上调30％，FK506组上调45％，小分子肽组上调15％。
　　 2.2.2.1.2、与F-actin结合drebrin的变化:吗啡依赖组表达上调50％，MK801组上调30％，FK506组上调15％。
　　 2.2.2.1.3、游离drebrin的变化:吗啡依赖组表达下调35％，吗啡戒断组下调25％，吗啡戒断对照组表达下调20％，MK801组下调40％，FK506组上调130％，小分子肽上调25％。
　　 2.2.2.1.4、结合与游离drebrin比例的变化:吗啡依赖组表达比例上调140％，吗啡戒断组表达比例上调100％，吗啡戒断对照组表达比例上调130％，MK801组上调120％，FK506组上调45％。
　　 2.2.2.2、海马中的变化
　　 2.2.2.2.1、总蛋白中drebrin的变化:吗啡依赖组表达上调40％，吗啡戒断组上调30％，MK801组下调20％，FK506组下调25％，小分子肽组下调25％。
　　 2.2.2.2.2、与F-actin结合drebrin的变化:吗啡依赖组表达上调50％，吗啡戒断组表达上调40％，吗啡戒断对照组表达下调40％，MK801组下调15％，FK506组下调40％。
　　 2.2.2.2.3、游离drebrin的变化:MK801组下调55％，FK506组下调65％，小分子肽组下调40％。
　　 2.2.2.2.4、结合与游离drebrin比例的变化:吗啡依赖组表达比例上调90％，吗啡戒断组表达比例上调65％，吗啡戒断对照组表达下调20％，MK801组上调55％，FK506组上调25％。
　　 2.2.2.3、纹状体中的变化
　　 2.2.2.3.1、总蛋白中drebrin的变化:吗啡依赖组表达下调50％，吗啡戒断组下调65％，MK801组下调15％，FK506组上调80％。
　　 2.2.2.3.2、与F-actin结合drebrin的变化:吗啡依赖组表达下调30％，吗啡戒断组下调35％，MK801组下调25％，FK506组下调35％。
　　 2.2.2.3.3、游离drebrin的变化:FK506组上调120％。
　　 2.2.2.3.4、结合与游离drebrin比例的变化:吗啡依赖组表达比例下调50％，吗啡戒断组表达比例下调20％，MK801组下调20％，FK506组下调25％。
　　 2.2.2.4、杏仁核中的变化
　　 2.2.2.4.1、总蛋白中drebrin的变化:吗啡戒断组下调20％，吗啡戒断对照组表达下调30％，FK506组下调25％。
　　 2.2.2.4.2、与F-actin结合drebrin的变化:吗啡戒断组下调50％，吗啡戒断对照组下调65％，FK506组下调40％。
　　 2.2.2.4.3、游离drebrin的变化:与对照组相比各组均无显著性变化。
　　 2.2.2.4.4、结合与游离drebrin比例的变化:吗啡戒断组表达比例下调50％，吗啡戒断对照组表达比例下调65％，FK506组下调55％。
　　 2.2.3、Cortactin的变化
　　 2.2.3.1、前额叶皮质中的变化
　　 2.2.3.1.1、总蛋白中cortactin的变化:吗啡依赖组表达上调25％，吗啡戒断组表达上调30％，MK801组下调30％，FK506组上调20％。
　　 2.2.3.1.2、与F-actin结合cortactin的变化:吗啡依赖组表达上调60％，吗啡戒断组表达上调75％，MK801组下调25％，FK506组上调55％。
　　 2.2.3.1.3、游离cortactin的变化:吗啡依赖组表达下调20％。
　　 2.2.3.1.4、结合与游离cortactin比例的变化:吗啡依赖组表达比例上调100％，吗啡戒断组表达比例上调130％，MK801组下调55％，FK506组上调45％。
　　 2.2.3.2、海马中的变化
　　 2.2.3.2.1、总蛋白中cortactin的变化:吗啡依赖组表达上调30％，吗啡戒断组表达上调30％，吗啡戒断对照组表达上调20％，MK801组上调25％，FK506组下调30％，小分子肽组上调15％。
　　 2.2.3.2.2、与F-actin结合cortactin的变化:吗啡依赖组表达上调80％，吗啡戒断组表达上调75％，吗啡戒断对照组表达上调30％，MK801组上调35％，小分子肽组上调30％。
　　 2.2.3.2.3、游离cortactin的变化:吗啡依赖组表达下调35％，吗啡戒断组表达下调30％，MK801组下调30％，FK506组下调40％。
　　 2.2.3.2.4、结合与游离cortactin比例的变化:吗啡依赖组表达比例上调60％，吗啡戒断组表达比例上调120％，吗啡戒断对照组表达比例上调20％，MK801组上调70％，FK506组上调60％，小分子肽组上调80％。
　　 2.2.3.3、纹状体中的变化
　　 2.2.3.3.1、总蛋白中cortactin的变化:吗啡依赖组表达下调50％，吗啡戒断组表达下调40％，MK801组下调40％，FK506组上调30％。
　　 2.2.3.3.2、与F-actin结合cortactin的变化:与吗啡戒断对照组表达下调15％，MK801组下调30％，FK506组下调25％。
　　 2.2.3.3.3、游离cortactin的变化:吗啡依赖组表达下调50％，吗啡戒断组表达下调40％，吗啡戒断对照组表达上调20％，FK506组上调40％。
　　 2.2.3.3.4、结合与游离cortactin比例的变化:吗啡依赖组表达比例上调60％，吗啡戒断组表达比例上调60％，吗啡戒断对照组表达比例下调25％，MK801组下调15％。
　　 2.3.4杏仁核中的变化
　　 2.2.3.4.1、总蛋白中cortactin的变化:吗啡戒断组表达下调15％，FK506组下调30％。
　　 2.3.3.4.2、与F-actin结合cortactin的变化:吗啡依赖组表达下调20％，吗啡戒断组表达下调20％，FK506组下调30％。
　　 2.2.3.4.3、游离cortactin的变化:吗啡戒断组表达下调20％。
　　 2.2.3.4.4、结合与游离cortactin比例的变化:MK801组下调15％，FK506组下调15％。
　　 2.2.4、Cofilin与P-cofilin的变化
　　 2.2.4.1、Cofilin的变化
　　 2.2.4.1.1、前额叶皮质中:吗啡依赖组下调20％，MK801组下调30％。
　　 2.2.4.1.2、海马中:吗啡依赖组表达上调20％，吗啡戒断组表达上调95％，小分子肽组下调15％。
　　 2.2.4.1.3、纹状体中:吗啡依赖组表达上调50％，吗啡戒断组表达上调85％，MK801组下调15％。
　　 2.2.4.1.4、杏仁核中:吗啡依赖组表达上调40％，吗啡戒断组表达上调45％，吗啡戒断对照组表达上调35％小分子肽组上调75％。
　　 2.2.4.2、P-cofilin与cofilin比值的变化
　　 2.2.4.2.1、前额叶皮质中:吗啡依赖组表达上调20％，吗啡戒断组表达上调35％，MK801组上调60％，小分子肽组上调30％。
　　 2.2.4.2.2、海马中:吗啡依赖组表达上调60％，吗啡戒断组表达上调15％，MK801组上调70％，FK506组上调20％，小分子肽组上调65％。
　　 2.2.4.2.3、纹状体中:吗啡依赖组表达上调55％，吗啡戒断组表达上调15％，吗啡戒断对照组表达下调15％，MK801组上调80％，FK506组上调15％，小分子肽组上调50％。
　　 2.2.4.2.4、杏仁核中:吗啡依赖组表达上调40％。
　　 2.2.5、Slingshot的变化
　　 2.2.5.1、前额叶皮质中:MK801组上调55％。
　　 2.2.5.2、海马中:吗啡依赖组上调30％，MK801组上调15％。
　　 2.2.5.3、纹状体中:吗啡依赖组上调30％，MK801组上调35％，FK506组上调20％。
　　 2.2.5.4、杏仁核中:小分子肽组下调15％。
　　 2.2.6、LIMK与P-LIMK的变化
　　 2.2.6.1、LIMK的变化
　　 2.2.6.1.1、前额叶皮质中:FK506组上调15％，小分子肽组下调30％。
　　 2.2.6.1.2、海马中:吗啡依赖组下调25％，小分子肽组下调25％。
　　 2.2.6.1.3、纹状体中:吗啡依赖组上调40％，MK801组下调30％，FK506组下调25％，小分子肽组下调30％。
　　 2.2.6.1.4、杏仁核中:吗啡依赖组上调60％，MK801组上调35％。
　　 2.2.6.2、P-LIMK与LIMK比值的变化
　　 2.2.6.2.1、前额叶皮质中:吗啡依赖组下调30％。
　　 2.2.6.2.2、海马中:吗啡依赖组下调30％，MK801组上调15％，FK506组上调45％。
　　 2.2.6.2.3、纹状体中:MK801组上调20％，FK506组上调20％。
　　 2.2.6.2.4、杏仁核中:吗啡依赖组下调40％，MK801组下调35％，FK506组上调15％。
　　 结论:大鼠吗啡依赖、戒断过程中成瘾相关脑区肌动蛋白发生了重构，P-cofilin可能发挥关键作用;吗啡诱导的肌动蛋白重构与改变drebrin、cortactin的含量及其与F-actin的结合性有关;急性吗啡处理诱导的肌动蛋白重构可能与ROCK2/LIMK通路有关;长期吗啡处理诱导的肌动蛋白重构可能与NMDA/Ca2+/Calcineurin/SSH通路有关。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 实验材料

2 试验方法

结果

1 急性吗啡处理组结果

2 急性药脑室内阻断注射组结果

4 成瘾大鼠脑室内阻断注射组结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历