富勒烯衍生物调控肿瘤微环境中成纤维细胞功能的初步研究

摘要

恶性肿瘤作为全球较大的公共卫生问题之一，极大地危害着人类的健康。随着肿瘤药理学的发展，改善肿瘤微环境已经成为一种重要的肿瘤治疗策略。肿瘤微环境是肿瘤所处的内环境，由肿瘤细胞、肿瘤局部浸润的免疫细胞、间质细胞及所分泌的活性介质等共同构成，在肿瘤的发生、发展及转移中起着重要的作用。在实体肿瘤的微环境中，成纤维细胞是最丰富一类细胞。在肿瘤微环境中，成纤维细胞获得一种活化表型，称为激活的成纤维细胞（activatedfibroblasts）或癌相关成纤维细胞（cancer-associatedfibroblasts，CAFs）。CAFs可以促进肿瘤的生长和扩散，通过其产生的多种生长因子以及趋化因子影响肿瘤细胞的各个方面。因此，成纤维细胞作为抗肿瘤治疗的新靶点受到了越来越多的关注。
　　 富勒烯衍生物由于自身独特的物理化学性质，近几年来已被开发用于癌症的诊断和治疗，可用于光动力治疗、光热治疗、放射治疗及化疗。但是，关于富勒烯衍生物的抗肿瘤研究大多针对于药物对肿瘤细胞的直接作用，而很少关注其对肿瘤微环境的影响。本文所用富勒烯衍生物为——富勒醇(C60(OH)22)及内嵌金属富勒醇(Gd@C82(OH)22，简写Gd@C82)。
　　 第一部分:富勒醇的合成
　　 目的:合成多羟基富勒烯衍生物——富勒醇，供后续实验所用。
　　 方法:采用四丁基氢氧化铵(TBAH)催化碱法合成富勒醇，并使用SephadexG-25层析柱进行纯化。利用透射电子显微镜对富勒醇形貌及粒径大小进行表征。
　　 结果:以90mg的富勒烯为原料，最终得到富勒醇92mg，产率为67.27％。透射电镜的表征结果显示，超纯水溶剂中富勒醇为粒径100-200nm的球形纳米颗粒。
　　 结论:采用TBAH催化碱法制备了富勒醇，产率较高，颗粒大小较均匀。
　　 第二部分:富勒烯衍生物对肿瘤微环境中CAFs增殖和分泌功能的影响及机制研究
　　 目的:研究富勒醇及Gd@C82对正常成纤维细胞HFL-1及CAFMCA205的影响，并初步探讨其作用机制。
　　 方法:
　　 1.不同浓度的富勒醇或Gd@C82培养MCA205和HFL-1细胞24h或72h，CCK-8法检测各组细胞活力。
　　 2.用25μM的富勒醇或Gd@C82处理MCA205细胞24h，收集其培养上清滤除药物后与正常培养基1∶1混合培养Lewis肺癌细胞，划痕实验检测Lewis肺癌细胞迁移能力。
　　 3.用含25μM富勒醇或Gd@C82的培养基培养细胞，24h或72h后，收集各组培养上清，ELISA检测其中TGF-β1、IL-6和VEGF的含量。
　　 4.免疫荧光法检测富勒醇或Gd@C82处理MCA205细胞72h后，细胞内TGF-β1表达情况。
　　 5.25μM的富勒醇或Gd@C82处理MCA205细胞24h或72h后，Westernblot检测细胞内TGF-β1蛋白的表达情况。
　　 6.25μM的富勒醇或Gd@C82处理MCA205细胞24h或72h后，Real-TimePCR检测细胞内TGF-β1mRNA的表达情况。
　　 结果:
　　 1.25μM的富勒醇或Gd@C82处理24h，对MCA205细胞的增殖均无显著抑制作用。50μM的Gd@C82处理24h，能显著抑制MCA205细胞的增殖。同时，25μM和50μM的富勒醇和Gd@C82对HFL-1细胞的增殖均无显著影响。
　　 2.对照组Lewis肺癌细胞划痕4h后开始迁移，而实验组细胞迁移不明显。
　　 3.以25μM的富勒醇或Gd@C82处理24h或72h，HFL-1细胞各组培养上清中TGF-β1含量无显著性差异。而MCA205细胞，实验组培养上清中TGF-β1含量显著低于对照组。同时富勒醇和Gd@C82能够显著降低MCA205细胞培养上清中IL-6及VEGF的含量。
　　 4.免疫荧光和Westernblot结果显示，富勒醇和Gd@C82均能下调MCA205细胞内TGF-β1蛋白的表达量，且该下调作用随作用时间延长而增强。
　　 5.Real-TimePCR结果显示，富勒醇或Gd@C82处理后的MCA205细胞的TGF-β1mRNA表达水平较对照组降低。
　　 结论:
　　 1.高浓度的Gd@C82能抑制MCA205细胞增殖，低浓度的富勒烯衍生物则无显著影响。无论高浓度还是低浓度的富勒烯衍生物均对正常成纤维细胞HFL-1的增殖无显著影响。
　　 2.富勒烯衍生物能抑制MCA205细胞分泌TGF-β1、IL-6及VEGF，从而使MCA205细胞培养上清的促肿瘤细胞迁移能力下降。
　　 3.富勒烯衍生物能在基因和蛋白水平抑制MCA205细胞生成TGF-β1，从而导致其下游细胞因子分泌的下降。
　　 4.选择性抑制增殖作用可能与富勒烯衍生物能选择性抑制MCA205细胞产生TGF-β1有关。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 富勒醇的合成

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 富勒烯衍生物对肿瘤微环境中CAFs增殖和分泌功能的影响及机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

结论

参考文献

综述

致谢

个人简历