MicroRNa-155调节TH1/TH17细胞分化并与多发性硬化发病机制相关

摘要

目的:多发性硬化是全球范围内常见的中央神经系统自身免疫性疾病，多见于中青年。然而对于其发病机制，人们尚不完全了解。比较公认的说法是，疾病初期时自身反应性淋巴细胞增多，通过血脑屏障(BBB)，导致神经轴突脱髓鞘形成病灶，自身反应性T细胞介导针对髓磷脂抗原的自身免疫应答引发炎症，使MS患者发生神经功能障碍。该病的原因主要包括遗传易感因素和环境因素。就患者的自身遗传易感因素而言，究竟MS患者与未患病人群相比较，他们的免疫系统调节有哪些不同昵？迄今仍未完全知晓。另外，目前多发性硬化的诊断主要依靠反复发作的病情，影像学和实验室检查来综合判断，缺乏灵敏性和特异性较高的实验室指标。而且，多发性硬化缺乏特效药物治疗，作为一种反复发作的慢性疾病，需要长期应用药物控制病情。
　　 机体受到抗原刺激后，原始的CD4+辅助性T细胞分化成效应T细胞参与适应性免疫应答。一直以来，Th1细胞被认为是效应性T细胞，在MS和实验性自身免疫性脑脊髓炎的发病机制中起着至关重要的作用。最近的研究表明，分泌白细胞介素17（IL-17）的辅助性T细胞（Th-17细胞）在清除外来病原体，诱发组织炎症反应，在自身免疫性疾病中起着重要的作用。已经发现，Th1和Th17分泌的细胞因子都曾在MS和EAE的脑组织检测出来;而小鼠体内IL-17的过量表达导致其体内的粒细胞增加。随后的研究表明，抑制小鼠的IL-17表达可以改善一些自身免疫性疾病，包括实验性自身免疫性脑脊髓炎。Th1细胞与Th17细胞分化是有不同的信号通路来管理的，虽然这些细胞的分化和功能通过特定的细胞因子和转录因子来调节，但是miRNA在自身免疫性炎症疾病中如何调节这些炎症性T细胞仍不完全了解。
　　 microRNAs(miRNAs)是一类进化上保守的微小非编码RNA，全长22bp左右，在细胞的生命活动中发挥着重要作用，是多种细胞生理过程强大而精细的调控者。最近发现其可以通过靶向miRNA降解或翻译抑制来调控转录，并可以直接调控免疫系统正常发育和功能所需的调节蛋白质表达。最近的研究表明，miRNA参与了多发性硬化的病理机制，在MS患者的大脑病灶、体液以及血清、血浆和血细胞中，多种miRNA均调节异常。还有研究证实，这些miRNA可以在敲入和敲除T细胞模型中调节T细胞激活基因，从而成为治疗的新靶点。更有研究通过miR-155基因敲除小鼠，研究这种miRNA的功能和治疗作用。
　　 本研究拟通过对多发性硬化患者血清中8种与自身免疫疾病相关的miRNA进行检测，寻找出与多发性硬化患者有密切关联的miRNA。并通过动物体内转染miRNA，研究其对EAE的治疗作用。最后通过体外转染CD4+T细胞，分析其对T细胞分化和功能的影响。以期找到多发性硬化更为敏感和特异的生物学标记，为治疗寻找新的靶点。
　　 方法:
　　 1.抽取MS患者、其他神经系统自身免疫疾病患者和正常对照者外周血，留取血清，抽提RNA。通过real-timePCR方法对已知与自身免疫相关的8种miRNAs进行检测，找出与MS密切相关的miRNAs，并检测这种miRNA在复发期和缓解期的MS患者血清中的变化。
　　 2.应用抗原MOG35-55免疫C57BL/6小鼠，并辅以完全弗氏佐剂、百日咳毒素及结核菌素，建立EAE模型。采用Knoz评分法给小鼠进行每日评分，连续观察25天。
　　 3.EAE组小鼠于诱导期，发病高峰期和缓解期处死，取材脑和脊髓，脾和周围淋巴结，应用realtimePCR方法测定miR-155，观察其在EAE不同时期的表达变化(n=5)。
　　 4.应用体内转染的方法将寡核苷酸miR-155类似物、抑制剂和各自的对照剂给随机分为4组的EAE小鼠进行尾静脉注射（miR-155类似物组、miR-155类似物对照组和miR-155抑制剂组、miR-155抑制剂对照组），并观察每组小鼠神经功能评分。
　　 5.miR-155类似物组和对照组小鼠于20天后处死，取材脑和脊髓，脾，肝，周围淋巴结抽提RNA,应用realtimePCR方法测定miR-155，检测转染效率(n=4)。
　　 6.体内转染寡核苷酸的4组小鼠于25天后多聚甲醛灌注，取材，石蜡包埋，脊髓切片，应用HE，LFB染色观察神经系统炎症细胞浸润和脱髓鞘情况(n=5)。
　　 7.体内转染寡核苷酸的4组小鼠分别于免疫13天、20天后处死，取脾和周围淋巴结，制备单细胞悬液，应用淋巴细胞分离液，分离淋巴细胞，完全1640培养液培养;应用MOG33-35再刺激48小时，收集细胞，应用流式细胞术，检测Th1细胞与Th17细胞比例;应用免疫磁珠分离纯化CD4+T细胞，并用CFSE和CCK8方法测定细胞CD4+T细胞增殖水平，抽提细胞中总RNA，应用realtimePCR方法测定IL-17，IFN-γ表达水平;取细胞培养液上清，应用ELISA方法测定细胞因子IL-17，IFN-γ(n=4)。
　　 8.未经处理的C57BL/6小鼠，取脾，制备单细胞悬液，应用淋巴细胞分离液，分离淋巴细胞，应用免疫磁珠分离纯化CD4+T细胞。应用miR-155类似物、抑制剂和各自的对照剂进行转染，完全1640培养液培养。应用CD3，CD28刺激T细胞增殖活化，Th17细胞趋化因子刺激Th17细胞分化。应用流式细胞术，检测Th1细胞与Th17细胞比例;应用realtimePCR方法测定IL-17，IFN-γ表达水平;取细胞培养液上清，应用ELISA方法测定细胞因子IL-17，IFN-γ水平(n=4)。
　　 结果:
　　 1.8种miRNAs中，miR-155在MS患者血清中明显增高;并且在MS患者、其他神经系统免疫疾病患者和正常对照者比较，miR-155在MS患者中水平增高，且与MS患者的病情严重程度呈正相关。
　　 2.miR-155在EAE小鼠中的表现，与MS患者相似，在疾病诱导期和高峰期水平较高，而疾病缓解期miR-155表达降低。
　　 3.在体内转染的寡核苷酸的4组的EAE小鼠(miR-155类似物组、miR-155类似物对照组和miR-155抑制剂组、miR-155抑制剂对照组)中，miR-155类似物组的EAE小鼠发病较早，病情较重;而miR-155抑制剂组的EAE小鼠发病较晚，病情较轻。
　　 4.关于体内转染效率，结果表明，miR-155水平在miR-155类似物组肝脏中表达最高，此外脑和脊髓，脾和周围淋巴结中的表达也较对照组2倍以上增高。
　　 5.脊髓切片的HE染色和LFB染色发现，miR-155类似物组的EAE小鼠，有较多的炎症细胞浸润，髓鞘脱失明显;而miR-155抑制剂组的EAE小鼠炎症细胞浸润较少，髓鞘脱失程度较轻。
　　 脊髓切片的IL-17免疫组化染色发现，miR-155抑制剂组的EAE小鼠炎症因子IL-17较miR-155类似物组明显减少。
　　 6.在疾病高峰期，miR-155类似物组小鼠脾细胞中，Th1细胞与Th17细胞比例不同程度增高，CD4+T细胞增殖增加，IL-17，IFN-γ基因表达和细胞因子IL-17，IFN-γ水平较高;淋巴细胞中，Th1细胞与Th17细胞比例增高较。而miR-155抑制剂组的EAE小鼠Th1细胞与Th17细胞比例，CD4+T细胞增殖下降，IL-17，IFN-γ基因表达和细胞因子IL-17，IFN-γ水平减低。
　　 7.在疾病诱导期，miR-155类似物组小鼠脾细胞中，Th1细胞与Th17细胞比例不同程度增高，CD4+T细胞增殖增加，IL-17，IFN-γ基因表达和细胞因子IL-17，IFN-γ水平较高;淋巴细胞中，Th1细胞与Th17细胞比例增高较。而miR-155抑制剂组的EAE小鼠Th1细胞与Th17细胞比例，CD4+T细胞增殖下降，IL-17，IFN-γ基因表达和细胞因子IL-17，IFN-γ水平减低。
　　 8.应用miR-155类似物、抑制剂和各自的对照剂进行体外转染CD4+T细胞，CD3，CD28刺激T细胞增殖活化后，Th1细胞比例在各组都较高，而Th17细胞比例变化不明显;应用Th17细胞趋化因子刺激后，miR-155类似物组CD4+T细胞向Th17分化明显增多，而miR-155抑制剂组的Th17细胞比例较低。同时，miR-155类似物组IL-17，IFN-γ基因表达和细胞因子IL-17，IFN-γ水平较高;而miR-155抑制剂组IL-17，IFN-γ基因表达和细胞因子IL-17，IFN-γ水平减低。
　　 结论:1.miR-155在MS患者血清中明显增高，并且与MS患者的病情严重程度呈正相关。提示miR-155可能成为MS疾病标志物。
　　 2.miR-155通过影响EAE小鼠Th1细胞与Th17细胞分化，影响炎症因子的表达水平，从而影响EAE的病程。体外实验也发现，miR-155影响Th17细胞转录因子，调节Th17细胞分化和炎症因子的表达水平。提示miR-155可能成为MS治疗的新靶点。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 MiRNA-155与多发性硬化的相关性研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 MiR-155通过调节Th1／T17分化影响实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)的病程

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 CD4+T细胞转染miR-155影响Th1／Th17细胞分化和功能

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 MiRNA与多发性硬化的研究进展

综述二 MicroRNA-155的免疫调控作用及研究进展

致谢

个人简历