混合DNA分析中混合比例推断的研究

摘要

目的:
　　 混合DNA分析是法医学中一个具有挑战性的难题。由于混合DNA中各种组分难以分离，混合DNA的基因分型结果表现为各组分的等位基因相互并存、相互重叠的现象，导致结果的分析异常复杂。对于法医实践中常见的混合DNA的短串联重复序列(shorttandemrepeats，STR)分型图谱，首先判断是否为混合DNA，其次判断是几个个体混合，然后推断各组分的混合比例，在此基础上，进一步推断各成分可能的基因型。混合比例推断的正确与否直接影响各组分基因型的推断结果，因此，混合比例推断是混合DNA分析中的一个关键问题。本课题拟从两方面研究影响混合DNA分析中混合比例推断的因素:1）Quantifiler Duo Quantification试剂盒初始DNA定量结果，2）Identifiler试剂盒基因分型图谱中各等位基因的峰型信息，旨在为准确推断混合比例提供有价值的指导和建议。
　　 方法:
　　 1、单一样本杂合型均衡比(Heterozygotebalance，Hb)的评估:按照知情同意原则，采集180份健康无关个体静脉血5ml。用QIAampDNABloodMidi试剂盒提取全血基因组DNA，并用AmpFLSTR(R)Identifiler(R)试剂盒进行PCR扩增，用ABI3130GeneticAnalyzer对PCR产物进行电泳分型，使用GeneMapperTMv3.2分析结果。另外，随机选择本实验室2012年使用本仪器获得的120个案件样本的STR分型图谱，计算上述300个样本每个基因座的杂合型均衡比。
　　 2、混合DNA模型制备:取女性标准品DNA9947A和男性标准品DNA2800M，另随机选取一个男性DNA样本和一个女性DNA样本（分别命名为M、F），用QuantifilerDuoDNAQuantification试剂盒对4个DNA样本进行定量。根据定量结果，将9947A、2800M稀释为0.5ng/μl，样本M、F稀释为1ng/μl。将2800M和9947A、M和F进行混合，混合比率(mixtureratio,Mr)为:1∶13、1∶11、1∶9、1∶7、1∶5、1∶3、1∶1、3∶1、5∶1、7∶1、9∶1、11∶1、13∶1。
　　 3、混合DNA定量:用QuantifilerDuoDNAQuantification试剂盒对上述制备的混合DNA样本进行定量，平行试验三次。用AB公司7500SDS软件V1.4.3分析混合DNA定量结果。统计男性DNA以及总DNA的量，计算混合比例，进行相关统计分析。
　　 4、混合DNA样本STR分型:用AmpFLSTR(R)Identifiler(R)试剂盒扩增混合DNA样本（2800M-9947A，M-F，ABI3130GeneticAnalyzer对PCR产物进行电泳分型，使用GeneMapperTMv3.2分析结果，平时试验三次。统计每个等位基因的峰高信息，根据混合比例公式计算混合比例并进行相关统计分析。
　　 5、统计学分析:对上述实验结果计算以下参数:Hb、APH、Mx、Mr、D'值、D值、残差值、平均残差值。Hb为一个杂合子两个不同的等位基因峰高比值，计算公式:Hb1=φsmaller/φlonger，φsmaller表示峰值较低的等位基因的峰高，φlonger表示峰值较高的峰高。平均峰高(Averagepeakheight，APH)杂合子的平均峰高为两等位基因峰高之和的一半。混合比例(mixtureproportion，Mx)表示混合DNA中某一组分的DNA在混合DNA中所占的比例。混合比例理论值用Mx表示，实时荧光定量计算所得的混合比例用Mx'表示，根据STR分型图谱推断的混合比例用Mx1表示。D值为Mx1与Mx差值的绝对值，D'值为Mx'与Mx差值的绝对值。混合比率(mixtureratio，Mr)表示混合DNA中各组分之间DNA量的比值。残差值=∑D2，平均残差值用残差'表示。残差'=∑D2/n，n为所检测的基因座的数目。应用Eccell，SPSS16.0软件对上述数据进行统计学分析，采用的统计方法包括配对t检验，Mann-whiteneyU检验，Kruakal-wallis检验，wilcoxonSignedRanks。
　　 结果:
　　 1、单一样本杂合型均衡比（Heterozygotebalance，Hb）的评估
　　 对180个血液样本提取的DNA进行STR分型，统计分析Hb的分布情况，结果显示所有样本的所有等位基因Hb均大于0.4，99.9％的样本Hb＞0.5，99.5％的样本Hb＞0.6。120个案件样本的Hb分布情况:Hb＞0.4、Hb＞0.5、Hb＞0.6的分别占样本总量的100％、99.4％、96.7％。300个样本综合统计，Hb＞0.6的占98.4％。其中D18S51，D2S1338基因座的Hb中位数值最低，为84.6％和85.6％。其余14个基因座Hb中位数均大于86.0％。D3S1358和Amelogenin基因座的Hb中位数最高，分别为90.0％和89.8％。
　　 2、混合DNA的DuoDNAQuantification定量结果对混合比例推断的影响
　　 2800M-9947A混合DNA的Mx与Mx'之间没有显著性差异。F-M混合DNA的Mx与Mx'之间有显著性差异。两组混合DNA的D'值均小于0.11。Mr＜1组和Mr＞1组的D'值分布有显著性差异，Mr＞1组的D'值大于Mr＜1组的D'值，即随着男性DNA成分在混合DNA中的比例不断增大，D'值也在不断增大，表明男性成分占主要成分时，使用该试剂盒检测并计算得出的混合比例与理论值具有较大差异。M-F混合DNA在Mr为11∶1、13∶1时，实时荧光定量结果显示男性DNA的量大于总DNA的量，故无法得到Mx'。说明当混合样本中男性成分所占比例大于91％时，应用DuoDNAQuantification试剂盒无法得到准确的混合比例数据。
　　 3、Identifiler试剂盒基因分型结果对混合比例推断的影响
　　 3.1、初始混合比例对Mx1推断的影响
　　 比较不同混合比率样本之间的D值，结果发现Mr＜1组6个混合比率的D值没有差异，Mr＞1组的6个混合比率的D值之间也没有差异。2800M-9947A混合样本中，Mr＞1组的D值较Mr＜1组大，有统计学差异。M-F混合样本中，Mr＞1组与Mr＜1组的D值之间无统计学差异。2800M-9947A混合DNA样本中，D7S820的D值较大，其中7个D值大于0.25，4个D值大于0.35，其余15个基因座的D值都在0.35以下。D21S11基因座和D16S539基因座在1∶13和13∶1混合比率时出现了等位基因丢失。95.1％的D值小于0.10。M-F混合样本的D值都在0.35以下，未出现等位基因丢失，96.2％的D值在0.10以下。
　　 3.2、基因座对Mx1推断的影响
　　 对于2800M-9947A混合样本和M-F混合样本，分别计算了15个STR基因座和Amelogenin性别基因座13个混合比率的的D值和残差值，对残差值进行Kruskal-wallis检验，结果显示16个基因座之间的残差值具有显著差异，说明该16个基因座对于混合比例的推断是有差异的。将16个基因座的Mx1和Mx进行配对t检验和WilcoxonSignedRanks检验，结果显示2800M-9947A混合样本Mx1与Mx没有统计学差异的基因座包括:CSF1PO、D5S818、D16S539、D18S51、FGA和vWA，其它的基因座均有统计学差异。M-F混合样本Mx1与Mx没有统计学差异的基因座包括:D2S1338、D7S820、D16S539、D18S51、D19S433、D21S11、TPOX、vWA。可见在两组混合DNA样本Mx1与Mx都没有差异的基因座包括vWA、D18S51、D16S539;都有差异的基因座为Ame(1)、D3S1358、D13S317、TH01、D8S1179。残差值结果也显示，两组混合样本中vWA、D18S51、D16S539的残差值较小，而Ame(1)、D3S1358、D13S317、TH01，D8S1179的残差值较大。
　　 3.3、等位基因共享对Mx1推断的影响
　　 2800M和9947A混合DNA样本中，有等位基因共享的基因座的平均残差值为0.182，无等位基因共享的平均残差值为0.022，表明无等位基因共享的较有等位基因共享的残差值要小。进一步比较无等位基因共享的基因型组合类型的残差值，发现4个等位基因的平均残差值为0.025，3个等位基因的平均残差值为0.023，2个等位基因的平均残差值为0.012。即无等位基因共享组中有2个等位基因(BB(∶)AA)的平均残差值最小。
　　 M-F混合DNA样本中，存在等位基因共享的基因座的平均残差值为0.048，无等位基因共享的为0.012。无等位基因共享的基因座中，有4个等位基因的基因座平均残差值为0.015，3个等位基因的平均残差值为0.010，2个等位基因的平均残差值为0.008。
　　 以上结果说明无等位基因共享比存在等位基因共享的基因座对于混合比例的推断更加精确，在无等位基因共享的三种形式中，只有2个等位基因的基因座对于混合比例的推断最准确。
　　 结论:
　　 1、混合DNA分析进行混合比例推断时，可首先应用QuantifilerDuoQuantification试剂盒进行初始DNA定量，并获得两样本的混合比例。但该试剂盒所得的的混合比例在女性样本为主要成分时较准确，男性样本为主要成分时准确性相对较低，当男性样本所占比例大于91％时，甚至无法得到混合比例的数据。
　　 2、依据基因分型图谱推断混合比例时，无等位基因共享的基因座推断的混合比例较有等位基因共享的基因座更准确。因此，Amelogenin基因座并不是最佳选择，建议首先选择无等位基因共享的基因座推断混合比例。

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