达托霉素产生菌的菌种选育及发酵工艺研究

摘要

达托霉素(Daptomycin)是一类新型的环脂肽类抗生素，由玫瑰孢链霉菌发酵得到。它具有独特的作用机制，能杀死绝大多数的革兰氏阳性菌，对耐药菌也有很强的活性。本论文对达托霉素产生菌的菌种选育及发酵工艺进行了系统的研究，以期获得高产的菌株及适宜的发酵工艺。
　　第一部分:达托霉素产生菌的菌种选育
　　菌种选育在抗生素生产中具有重要的作用。选择适宜的方法可以提高筛选的效率，降低工作的强度。
　　目的:对本实验室自主分离的野生型达托霉素产生菌进行不同方法的诱变处理，筛选达托霉素的高产菌株。
　　方法:选择诱变成功率较高的方法对本实验室自主分离的野生型达托霉素产生菌进行诱变处理，筛选达托霉素的高产菌株。选择的方法有:紫外诱变、化学诱变、原生质体紫外诱变、癸酸抗性筛选。甘油管保藏筛选得到的高产菌株。
　　结果:紫外诱变处理野生型达托霉素产生菌D-0，筛选得到达托霉素的高产突变株D-146，其达托霉素产量达到62.8mg/L，与出发菌株D-0相比达托霉素产量提高了121.1％。
　　亚硝基胍NTG诱变处理达托霉素的高产菌株D-146，筛选得到达托霉素的高产突变株D-336，其达托霉素产量达到131.3mg/L，与出发菌株D-146相比达托霉素产量提高了109.1％。
　　原生质体紫外诱变处理达托霉素的高产菌株D-336，筛选得到达托霉素的高产突变株D-406，其达托霉素产量达到325.2mg/L，与出发菌株D-336相比达托霉素产量提高了147.7％。
　　癸酸抗性诱变处理达托霉素的高产菌株D-406，筛选得到达托霉素的高产突变株D-699，其达托霉素产量达到428.1mg/L，与出发菌株D-406相比达托霉素产量提高了31.64％。
　　第二部分:达托霉素产生菌的发酵工艺研究
　　特定的菌株有其最适宜的培养基及培养条件，优化温度、pH、溶氧等培养条件能使菌株得到最佳的生长环境，从而生产出更多的目标产物。
　　目的:考察不同发酵条件对达托霉素高产菌株的摇瓶发酵的影响，确定达托霉素摇瓶发酵的最佳发酵工艺;在20L发酵罐验证摇瓶最佳发酵工艺放大培养的可行性。
　　方法:考察斜面培养时间、培养温度、培养基初始pH、摇床转速、前体添加浓度、种龄、发酵培养时间等因素对高产突变株D-699发酵的影响;采用均匀设计法优化发酵培养基。将优化的发酵工艺在摇瓶和20L发酵罐进行发酵培养，比较摇瓶和20L发酵罐发酵后的达托霉素产量。
　　结果:达托霉素高产菌株D-406的最佳培养条件为:斜面培养时间10天、发酵温度28℃、摇床转速220 rpm/min、种子培养基初始pH值7.5、发酵培养基初始pH值7.0-7.5、接种量0.5％、种龄30小时、发酵时间5天、最适癸酸添加浓度0.4％。
　　达托霉素发酵培养的最适碳氮源分别为葡萄糖、可溶性淀粉、酵母粉、蛋白胨;采用均匀设计优化培养基成分的组成，最优的碳氮源配比为葡萄糖∶可溶性淀粉∶酵母粉∶蛋白胨为1.2∶1∶1∶2。
　　摇瓶发酵工艺优化后的达托霉素产量达到533.7mg/L，比优化前提高了24.67％。
　　20L发酵罐发酵达托霉素的最适搅拌转速为300rpm/min、流加癸酸时癸酸的最适添加浓度为0.5％。摇瓶优化的发酵工艺在20L发酵罐进行放大验证，达托霉素的产量为586.4mg/L比摇瓶结果提高了9.87％。
　　结论:本论文采用多种诱变成功率较高的诱变方法处理野生型达托霉素产生菌D-0，筛选得到了达托霉素高产菌株D-699，摇瓶发酵单位达到428.1mg/L，比原始菌株D-0提高了约15倍，D-699连续传代5代后它的摇瓶发酵单位波动仅2.5％，表明其遗传特性稳定。考察了不同因素对高突变株D-699发酵的影响，优化了高突变株D-699的发酵培养基配方。高突变株D-6991优化摇瓶发酵工艺后达托霉素产量提高到533.7mg/L;比优化前提高了24.67％。优化后的摇瓶发酵工艺在20L发酵罐放大时达托霉素的产量为586.4mg/L比摇瓶结果提高了9.87％，表明优化的配方能够放大生产。

目录

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摘要

引言

第一部分 达托霉素产生菌的菌种选育

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 托霉素产生菌的发酵工艺研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 达托霉素研究进展

致谢

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