DSS所致的慢性实验性结肠炎加重CCl4诱导的肝纤维化及其机制研究

摘要

肝纤维化(hepaticfibrosis，HF)是肝脏对病毒、酒精、代谢毒物等各种致病因子所致的组织修复反应。肝纤维化是可逆的，而肝硬化却难以逆转。因此研究肝纤维化的发病机制并尽早干预对阻止疾病进展甚或逆转肝纤维化具有重要意义。近年研究发现，肠道炎症可加重高脂饮食诱导的非酒精性脂肪性肝炎，因此肠黏膜屏障受损可能在肝脏疾病的发生发展中起到一定作用。
　　在炎症性肠病(inflammotoryboweldisease，IBD)的研究中发现，肝胆系统病变是其最常见的肠外表现之一。IBD发病时，肠黏膜屏障功能受损，引起肠道菌群失调，继发细菌移位，导致内毒素血症，进而引起肝损伤。Marshall于1998年正式提出了“肠-肝轴”的概念，指出肠道和肝脏在对机体免疫防御功能上是相互影响，相互调节，密不可分的。肠黏膜屏障功能受损，肠道菌群，内毒素进入门脉系统进而诱发肝脏疾病。此外，肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎等肝脏疾病常伴有肠源性内毒素血症(intestinalendotoxemia，IETM)，这可能与肝病时肠道内毒素吸收增多有关。
　　肝星状细胞(hepaticstellatecells，HSCs)的活化增殖是肝纤维化发生的中心环节。活化的HSCs分泌大量趋化因子，引起肝巨噬细胞(Kupffercell，KCs)聚集到损伤部位产生大量TGF-β。脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)激活星状细胞表面的Toll样受体4(Tolllikereceptor4，TLR4)通过MyD-88-NF-κB途径下调TGF-β诱导受体，增强TGF-β信号转导通路促进纤维化的发生。
　　LPS是革兰氏阴性细菌内毒素的重要成分，细菌裂解或黏附在其他细胞上时得以释放。TLR是识别病原微生物的主要受体，其中，TLR4在人体免疫中发挥重要作用。TLR4是LPS信号导入细胞内的表面受体，当与LPS结合后，TLR4通过其胞浆域募集衔接蛋白MyD-88(Myeloiddifferentiationprotein88)，进一步作用于其下游分子TNF-α受体活化的因子6(tumornecrosisreceptor-associatedfactor,TRAF6)，随后引起NF-κB的活化，导致大量促炎症细胞因子的产生从而介导肝脏病变。GabeleE等的研究，表明非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholicsteatohepatitis，NASH)伴有肠道炎症，会明显促进肝脏病变，证实结肠炎症可能通过“肠-肝轴”介导肝脏病变。为此，我们联合腹腔注射CCl4与饮用DSS诱导建立了小鼠肝纤维化伴肠道损伤模型，来研究结肠炎症对肝脏炎症和纤维化病变的影响;同时观察慢性实验性结肠炎相关的肝脏病变情况，并探讨内毒素及肠肝轴在其中的作用，从而为延缓肝纤维化的进展以及IBD的综合治疗提供理论依据。
　　目的:研究DSS所致的慢性实验性结肠炎加重CCl4诱导的肝纤维化的机制。
　　方法:将50只雄性C57BL/6小鼠按完全随机法分为conrtol组（正常饮食），DSS组(间断饮用2％DSS)，Oliveoil组（腹腔注射橄榄油10μL/g，每周2次），CCl4组（腹腔注射5％CCl4橄榄油10μL/g，每周2次）和CCl4+DSS组(间断饮用2％DSS联合腹腔注射5％CCl4橄榄油10μL/g)，每组10只。结肠黏膜炎症程度的评估包括疾病活动指数(Diseaseactivityindex，DAI)、结肠形态学变化和组织病理学评分，检测结肠组织中MPO的含量;测定血清LPS水平及细菌移位率;分别应用免疫组织化学染色、Westernblot技术和real-timePCR技术检测结肠组织中TNF-α，IFN-γ，IL-17A，紧密连接蛋白occludin，claudin-1的表达水平;应用Haematoxylin&eosinstaining(H&E染色)、Masson'strichromestaining(MT染色)、Siriusredstaining（天狼猩红染色）等方法观察肝脏病理学改变;分别采用免疫组织化学染色、westernblot和real-timeQ-PCR方法检测各组小鼠肝脏组织中TNF-α、IFN-γ、IL-17A、TGF-β1、α-SMA、Ⅰ、Ⅲ型胶原、MMP-2、TIMP-2、TLR4、TRAF6和NF-κB的表达水平。
　　结果:①与对照组相比，DSS组和CCl4+DSS组小鼠体重显著减轻，DAI显著升高，结肠壁充血、水肿、长度显著缩短，结肠组织病理切片示大量炎症细胞浸润，黏膜上皮破坏形成浅溃疡，病理评分显著增加;MPO活性显著升高;免疫组织化学检测、Westernblot和real-timeQ-PCR检测结果显示TNF-α、IFN-γ和IL-17A表达水平显著升高（P＜0.05）;而这两组之间没有明显差异(P＞0.05);②肝脏组织H&E显示:DSS组可见肝内汇管区炎症细胞浸润增加，肝细胞排列散乱，肝细胞水肿、胞浆疏松化;CCl4组及CCl4+DSS组均可见到肝脏组织肝板排列紊乱，肝细胞水肿、胞浆疏松化，可见肝细胞空泡样变性，大量肝细胞变性坏死，汇管区大量炎性细胞浸润，尤以CCl4+DSS组显著;炎症评分结果显示:DSS组、CCl4组、CCl4+DSS组均显著高于对照组，尤以重叠组升高明显;差异具有统计学意义（P＜0.05）;③肝脏组织MT染色、天狼猩红染色显示，DSS组可见肝小叶中央静脉壁纤维染色，汇管区及小叶间隔内少许纤维组织沉积，较对照组无明显变化;CCl4组及CCl4+DSS组均可见到肝小叶结构紊乱，增生小胆管周围纤维组织生成，中央静脉周围及汇管区可见纤维组织沉积增多，肝纤维化形成但是此种病变尤以CCl4+DSS组病变严重;纤维化程度分级显示:DSS组较正常对照组小鼠相差不大（P＞0.05），CCl4组、CCl4+DSS组肝脏纤维化程度分级显著高，尤以重叠组升高显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）;④羟脯氨酸测试盒检测结果显示，同正常对照组相比，DSS组小鼠羟脯氨酸含量略升高，差异无统计学意义(P＞0.05);CCl4组小鼠和CCl4+DSS组小鼠羟脯氨酸含量明显升高，CCl4+DSS组含量显著高于单纯CCl4组小鼠，差异具有统计学意义（P＜0.05）;⑤血清肝功能检测显示，同正常对照组相比，DSS组小鼠血清丙氨酸氨基转移酶(alanineaminotransferase，ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(aspartateaminotransferase，AST)水平明显升高，白蛋白(albumin，ALB)水平明显减少（P＜0.05），血清总胆红素(totalbilirubin，TBIL)、直接胆红素(directbilirubin，DBIL)水平相差不大(P＞0.05);CCl4组和CCl4+DSS组小鼠ALT、AST、TBIL及DBIL水平明显增高，ALB水平明显下降，CCl4+DSS组变化较单纯CCl4组小鼠显著，差异具有统计学意义（P＜0.05）;⑥免疫组织化学染色、Westernblot和real-timeQ-PCR检测肝脏中TNF-α、IFN-γ和IL-17A结果显示:DSS组、CCl4组、CCl4+DSS组小鼠肝脏组织其表达水平，较对照组显著增加，尤以CCl4+DSS组变化显著(P＜0.05）;⑦免疫组织化学染色、Westernblot和real-timeQ-PCR检测肝脏中CollagentypeⅠ、CollagentypeⅢ结果显示:DSS组较正常对照组变化不明显，差异无统计学意义（P＞0.05）;CCl4组、CCl4+DSS组较对照组显著增加，尤以CCl4+DSS组变化显著(P＜0.05）;⑧免疫组织化学染色、Westernblot和real-timeQ-PCR检测肝脏组织中α-SMA、TGF-β1、MMP-2和TIMP-2结果显示:DSS组较正常对照组变化不明显，差异无统计学意义(P＞0.05);CCl4组、CCl4+DSS组较对照组显著增加，尤以CCl4+DSS组变化显著（P＜0.05）;⑨与对照组相比，DSS组、CCl4组、CCl4+DSS组小鼠血清中LPS水平显著增加（P＜0.05）;而CCl4+DSS组与CCl4组比较，其LPS含量显著升高（P＜0.05）;正常对照组肠系膜淋巴结匀浆液中细菌移位率为0％;DSS组小鼠细菌移位率为80％;橄榄油组匀浆液细菌培养发现个别有大肠杆菌生长，其细菌移位率为10％;CCl4组小鼠细菌移位率为60％;CCl4+DSS组细菌移位率为90％;免疫组织化学染色、Westernblot和real-timeQ-PCR检测结果显示紧密连接蛋白occludin和claudin-1表达,与对照组相比，DSS组、CCl4+DSS组结肠黏膜蛋白阳性面积显著减少（P＜0.05），而这两组之间没有明显差异（P＞0.05）;⑩免疫组织化学染色、Westernblot和real-timeQ-PCR检测肝脏中TLR4、TRAF6和NF-κB结果显示:DSS组、CCl4组及CCl4+DSS组小鼠表达水平较对照组升高，尤以CCl4+DSS组升高更为显著，差异具有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:肝纤维化伴有肠道炎症会明显促进肝脏病变的进程，其机制可能与损伤的肝脏对肠源性内毒素清除能力下降，加之存在肠道炎症，会明显促进LPS移位，从而上调LPS/TLR4信号转导通路介导肝脏病变有关。

目录

声明

摘要

英文缩写

前言

材料与方法

1 材料

2 主要试剂的配制

3 方法

结果

1 动物的一般状况

2 不同动物模型的结肠炎症的改变

3 各组小鼠的肝脏炎症及纤维化病变情况

4 结肠黏膜屏障的改变

5 肝组织TLR4、TRAF6和NF-κB蛋白及其mRNA表达的影响

附图

讨论

结论

参考文献

综述 肠-肝轴在慢性肝病中的研究新进展

致谢

个人简历