食管鳞癌中RASSF5不同转录本的表达及其表观遗传学失活机制的研究

摘要

目的:食管癌是人类常见的恶性肿瘤之一，我国是世界食管癌的高发国。中国北方地区尤其是沿太行山脉的河南河北等地是食管癌高发区之一，以食管鳞癌最常见。食管癌症状隐匿，就诊时多处于中晚期，相当部分的病人已不能手术治疗，预后较差，因此提高食管癌早期诊断率和加强病因学研究以便进行一级预防，十分必要。目前普遍认为食管癌是多因素、多基因、多阶段的复杂发生发展过程，其病因和发病机制尚未完全阐明。
　　除DNA核苷酸序列改变可影响肿瘤发生发展外，表观遗传学机制在肿瘤形成过程中的作用越来越受到重视。DNA甲基化是最早发现的基因修饰途径之一，是表观遗传学的重要组成部分，在维持正常细胞功能、胚胎发育及肿瘤发生中起着重要作用。肿瘤相关基因DNA甲基化状态的改变在肿瘤中普遍存在，DNA甲基化在肿瘤发生发展中的作用是当前的研究热点。研究发现肿瘤的发生可能与抑癌基因启动子区CpG岛甲基化造成的抑癌基因失活有关，因此抑癌基因是目前肿瘤甲基化研究的主要热点。RASSF5（又名NORE1）是Ras相关区域家族中的一个成员，是鼠类Ras受体Nore1的人类同系物，位于染色体1q32.1。由于选择性剪接和不同的启动子使用，RASSF5包含三种不同的转录本，RASSF5A、RASSF5B和RASSF5C。它们的外显子各不相同，RASSF5A包含外显子1、2、4、5、6、7，RASSF5B包含外显子1、2、4、5、7，RASSF5C包含外显子3、4、5、6、7。不同的转录本在食管鳞癌中所起的作用可能不同。本研究通过检测食管鳞癌组织中RASSF5基因不同转录本的mRNA表达，确定相应表达转录本后再研究此转录本在食管癌细胞中的mRNA表达及其甲基化状态，在食管鳞癌组织中的蛋白表达情况以及甲基化状态，探讨RASSF5基因不同转录本在食管鳞癌中的表达及临床意义。
　　方法:
　　1应用逆转录-聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chainreaction，RT-PCR)技术分别检测49例食管鳞癌组织及癌旁正常组织中 RASSF5基因不同转录本的mRNA表达情况以及DNA甲基转移酶抑制剂5-氮杂-2'-脱氧胞苷（5-aza-2'-deoxycitydine，5-aza-dC）处理前后的食管癌细胞系(TE1、TE13、T.Tn、Ec109)中RASSF5A的mRNA表达情况。
　　2应用甲基化特异性PCR(methylation specific polymerase chain reaction，MSP)技术分别检测应用5-aza-dC处理前后的食管癌细胞系和49例食管鳞癌组织及癌旁正常组织中RASSF5A基因的甲基化状态。
　　3应用免疫组织化学(immunohistochemistry) SP法检测49例食管鳞癌组织及癌旁正常组织中RASSF5A蛋白的表达情况。
　　4运用统计软件SPSS13.0对数据进行统计学分析。
　　结果:
　　1食管鳞状上皮组织中RASSF5不同转录本的mRNA表达
　　RASSF5A转录本是主要在食管鳞状上皮中表达的转录本，转录本RASSF5B和RASSF5C在食管鳞状上皮中的表达均很低。
　　2食管癌细胞中RASSF5A的mRNA表达及甲基化状态
　　2.15-aza-dC处理前后食管癌细胞系中RASSF5A的mRNA表达
　　四株未处理的食管癌细胞株中，TE1、Ec109细胞株中RASSF5A基因mRNA表达呈弱阳性，TE13、T.Tn细胞株中RASSF5A基因表达缺失，用甲基化抑制剂5-aza-dC处理后，TE1、Ec109细胞株中RASSF5A基因表达增高，TE13、T.Tn细胞株中均检测出RASSF5A mRNA的表达。
　　2.25-aza-dC处理前后食管癌细胞系中RASSF5A的甲基化状态
　　四株未处理的食管癌细胞系中，TE1细胞中RASSF5A基因表现出不完全甲基化，其余三株细胞系中RASSF5A基因启动子区呈高甲基化状态，应用甲基化抑制剂5-aza-dC处理后，TE1细胞株中RASSF5A基因甲基化程度降低，非甲基化程度增加，其余三种细胞株中RASSF5A基因均表现为非甲基化状态。
　　3食管鳞癌组织中RASSF5A基因的表达、甲基化状态及其与临床病理资料之间的关系
　　3.1食管鳞癌组织中RASSF5A基因mRNA的表达
　　RASSF5A基因mRNA在食管鳞癌和癌旁正常组织的表达量分别为0.57±0.18和0.87±0.10，食管鳞癌组织中RASSF5A基因的mRNA表达量明显低于癌旁正常组织，两者的差异有统计学意义(t=-10.201，P=0.000)。在食管鳞癌患者中，RASSF5A的mRNA表达与患者的淋巴结转移情况及肿瘤组织的分期和分化程度有关（P＜0.05），而与患者的年龄和性别无关(P＞0.05)。
　　3.2食管鳞癌组织中RASSF5A基因蛋白的表达
　　49例食管鳞癌组织中，RASSF5A蛋白表达阳性率为26.5％(13/49)，49例正常食管黏膜组织中，RASSF5A蛋白表达阳性率为75.5％(37/49)，食管鳞癌组织中RASSF5A基因蛋白表达阳性率显著低于癌旁正常组织，两者的差异有统计学意义(P=0.000)。在食管鳞癌中，RASSF5A蛋白表达与患者的淋巴结转移情况和肿瘤组织的分化程度有关(P＜0.05)，而与年龄、性别以及肿瘤组织的分期无关（P＞0.05）。
　　3.3食管鳞癌组织中RASSF5A基因甲基化状态
　　RASSF5A基因启动子区在食管鳞癌组织和癌旁正常组织中的甲基化率分别55.1％(27/49)和28.6％(14/49)。食管鳞癌组织中RASSF5A基因启动子区甲基化率显著高于癌旁正常组织(P=0.011)。RASSF5A基因在食管鳞癌组织中的甲基化率与年龄、性别以及肿瘤组织分期无关（P＞0.05）。低分化鳞癌组RASSF5A基因启动子区甲基化发生率75.9％(22/29)显著高于高中分化鳞癌组甲基化发生率25.0％(5/20)(x2=12.377，P=0.000);RASSF5A基因启动子区在有淋巴结转移组的甲基化发生率80.8％(21/26)显著高于无淋巴结转移组的甲基化发生率26.1％(6/23)(x2=14.750，P=0.000)。
　　3.4 RASSF5A基因甲基化、mRNA和蛋白表达之间的关系
　　RASSF5A蛋白表达阳性的食管鳞癌组织中，其mRNA相对表达量为0.68±0.17，RASSF5A蛋白表达阴性的食管鳞癌组织中，其mRNA相对表达量为0.52±0.16，两者差异有统计学意义（t=-3.036，P=0.007）。在RASSF5A基因启动子区甲基化阳性的食管鳞癌组织中，其mRNA相对表达量为0.51±0.16，甲基化阴性的食管鳞癌组织中mRNA相对表达量为0.64±0.17，两者差异有统计学意义(t=-2.737，P=0.009)。发生RASSF5A基因启动子区高甲基化的食管鳞癌组织中RASSF5A蛋白表达阳性率为11.1％(3/27)，RASSF5A基因启动子区甲基化阴性的食管鳞癌组织中RASSF5A蛋白表达阳性率为45.5％(10/22)，两者差异有统计学意义(x2=7.335，P=0.007)。RASSF5A基因启动子区甲基化与其蛋白表达之间呈负相关(R=-0.387，P=0.006)。
　　结论:
　　1食管鳞状上皮组织中主要表达的RASSF5的转录本可能是RASSF5A。
　　2甲基转移酶抑制剂5-aza-dC能够逆转RASSF5A基因的甲基化，使RASSF5A恢复表达，提示RASSF5A基因启动子区异常高甲基化可能是导致其在食管癌细胞中表达缺失的重要机制之一。
　　3食管鳞癌组织中RASSF5A基因启动子区甲基化率显著高于癌旁正常组织，表明RASSF5A基因启动子区甲基化可能与食管癌的发生有关。
　　4 RASSF5A启动子区甲基化与食管鳞癌患者的淋巴结转移及组织分化程度有关，提示RASSF5A基因启动子区甲基化状态可能与食管鳞癌的转移密切相关。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 研究对象

2 主要实验仪器及试剂

3 实验方法

4 统计学分析

结果

1 食管鳞状上皮组织中RASSF5不同转录本的mRNA表达

2 食管癌细胞中RASSF5A的mRNA表达及其甲基化状态

3 食管鳞癌组织中RASSF5A基因的表达、甲基化状态及其与临床病理资料之间的关系

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 RASSF5在肿瘤中的研究进展

致谢

个人简历