以Bcl-2修饰的同种异体骨髓间充质干细胞移植对兔心梗后心功能不全的影响

摘要

目的:心肌梗死(MI，myocardial infarction)对人类健康构成严重威胁。MI后心室重构的发生严重影响了MI患者的生活质量。MI后心功能不全已成为患者死亡的主要原因。目前尽管MI的死亡率下降，但MI后心功能不全仍未改善，已成为家庭及社会沉重的负担。心功能不全是各种心脏疾病的终末阶段。药物治疗可以缓解病情，但是无法使受损的心肌细胞再生。要使心肌细胞再生乃至衰竭的心脏恢复功能仍是一项巨大的挑战。干细胞治疗对于逆转终末期损伤心脏是最有希望的治疗方法。间充质干细胞(MSCs，mesenchymal stem cells)存在于多种成体组织内，骨髓是MSCs的主要来源。骨髓间充质干细胞(BMSCs,bone marrow mesenchymalstem cells)可参与受损心肌的重建，可以提高左室射血分数，降低左心室收缩末期和舒张末期容积、减少梗死面积并改善左室重构。由于MI后微环境的改变使BMSCs在梗死心肌中不能长期存活从而限制了干细胞的修复能力。人们试图通过基因工程的方法来解决这一问题。基因工程是将外源性基因导入目的细胞中，使得该细胞具备过表达或静默表达某种基因的能力。对干细胞加以基因修饰，使干细胞具有更好的促血管再生、抗细胞凋亡、抗炎、修复心功能的作用。外源性基因导入目的细胞中有病毒载体系统和非病毒载体系统。非病毒载体的转导效率低。目的基因只能实现瞬间表达，容易引发免疫反应和被机体所清除。本实验采用腺病毒转染BMSCs，转染效率高，无毒副作用。Bcl-2是具有明显抑制凋亡作用的基因，以Bcl-2修饰BMSCs可作为提高移植细胞存活率的手段。本研究目的在于观察经Bcl-2修饰的同种异体BMSCs移植对兔心梗后心功能不全模型心功能的影响。
　　方法:制备含目的基因Bcl-2的原始质粒。将目的基因Bcl-2从原始质粒上切下连接到pShuttle-CMV-EGFP重组穿梭载体。将验证正确的pShuttle-CMV-EGFP-Bcl-2转移到pAdeno载体上，得到pAdeno-Bcl-2病毒质粒。大量制备重组质粒，共转染293细胞，收集病毒(P1代病毒)。以P1代腺病毒感染293细胞，连续三代反复扩增收集病毒，至P4代行病毒的大量扩增。经反复冻融后保存，于-80℃保存待用。采集3月龄兔胫骨骨髓，用密度梯度离心法和贴壁法培养骨髓间充质干细胞至第九代。用带绿色荧光蛋白标记的空载体腺病毒及带有Bcl-2基因的腺病毒分别转染上述培养细胞。结扎冠状动脉前降支制作心功能不全模型。两周后根据超声心动图结果选取造模成功模型，即左室射血分数(LVEF，leftventricular ejection fraction)≤50％，并随机分为Ad-EGFP-Bcl-2组(n=6)、Ad-EGFP组(n=6)和DMEM组(n=6)。开胸进行细胞移植，Ad-EGFP-Bcl-2组移植Ad-EGFP-Bcl-2-BMSCs、Ad-EGFP组移植Ad-EGFP-BMSCs、DMEM组注入等量DMEM。4周后行心脏超声检查，测量LVEF、左室缩短率(FS，left ventricular fractional shortening)、左室舒张末内径(LVEDD，left ventricular end-diastolic diameter)、左室收缩末内径(LVESD，left ventricular end systolic diameter)，并用实时荧光定量PCR检测梗死边缘区心肌组织Bcl-2的表达。分析心功能与Bcl-2的表达的相关性。HE染色观察心肌病理改变，荧光显微镜下观察标记的骨髓间充质干细胞的生存。
　　结果:
　　1.Ad-Bcl2-GFP腺病毒滴度为2.5×1010PFU/ml;
　　2.采用密度梯度离心法和贴壁法成功培养出BMSCs，传至十二代细胞状态仍很好;
　　3.本实验采用第九代BMSCs，最佳MOI为500，感染36h后观察到EGFP表达，腺病毒转染率100％;
　　4.成功制备兔心梗后心功能不全模型，造模后存活21只，2周后根据心脏彩超结果及造模成功判定标准(LVEF≤50％)，共有18只造模成功。
　　5.Ad-EGFP-Bcl-2组和Ad-EGFP组与DMEM组相比，心功能改善均优于DMEM组，Ad-EGFP-Bcl-2组改善更明显。EF值[(68.222±3.763)％,(57.056±3.555)％,(47.389±5.567)％,P=0.000], EDD值[(9.556±0.981)mm,(11.611±0.828) mm,(13.389±1.569) mm,P=0.000], ESD值[(5.722±0.647)mm,(7.889±0.544) mm,(9.889±0.749)mm, P=0.000], FS值[(39.167±3.817)％，(31.833±2.492)％，(25.778±3.851)％，P=0.000];
　　6.心肌梗死边缘区Bcl-2表达在Ad-EGFP-Bcl-2组明显提高(1.015±0.115，0.358±0.057，0.090±0.065，P=0.000)，差异均有统计学意义;
　　7.EF与Bcl-2表达呈正相关，相关系数R为0.940，决定系数R2为0.883，回归方程及所有系数均有统计学意义，回归方程为Y=46.664+22.329X;
　　8.移植细胞存活率提高了，在荧光显微镜下Ad-EGFP-Bcl-2组BMSCs数目是Ad-EGFP组的1.5倍;
　　9.Ad-EGFP-Bcl-2组和Ad-EGFP组与DMEM组相比，病理改变较轻，Ad-EGFP-Bcl-2组效果更好。
　　结论:间充质干细胞易于分离并且大量培养，易于被外源基因转染并稳定表达，同种间无免疫原性。本实验采用腺病毒转染BMSCs，转染效率高，无毒副作用。经Bcl-2修饰的同种异体骨髓间充质干细胞移植可更好地抑制心室重构，改善兔心梗后心功能。其机制可能与抑制凋亡、提高移植后干细胞存活率有关。

目录

声明

摘要

前言

材料方法

1 材料

2 方法

结果

1 腺病毒载体构建结果

2 BMSCs形态观察

3 荧光显微镜下转染细胞形态

4 动物心功能不全模型结果

5 心脏超声检查

6 PCR结果

7 EF与Bcl-2相关性

8 荧光显微镜下观察细胞存活

9 病理学变化

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 基因工程在骨髓间充质干细胞治疗心肌梗死中的应用

致谢

个人简历