自体PRP对成骨细胞骨涎蛋白表达的影响

摘要

目的:随着人们生活水平的提高，人们对口腔种植的需求逐渐增加。自从上个世纪60年代，由Branemark教授等提出种植体-骨界面的“骨结合”理论，种植技术和理论研究得到飞快的发展。目前口腔种植中常见的问题主要为不能形成良好骨结合和局部骨量不足的问题，为了解决这个问题，很多学者做了大量的相关研究。骨髓基质干细胞(BMSCs)是组织工程理想的种子细胞，它可以在体外定向诱导为成骨细胞。富血小板血浆(PRP)被刺激后可以释放大量的生长因子，这些生长因子可以促进骨缺损的修复和重建。骨涎蛋白(BSP)是成骨细胞分化成熟的标志，在成骨细胞矿化的晚期特异性表达。本研究体外诱导兔BMSCs分化为成骨细胞，将兔全血所制备的自体PRP作用于成骨细胞，探讨自体PRP在不同时间段对成骨细胞增殖、分化和矿化的影响，进一步揭示PRP的作用机制，为临床中合理使用PRP提供实验依据。
　　方法:
　　①BMSCs的培养:将3月龄新西兰大白兔以戊巴比妥钠经耳缘静脉麻醉，以16号骨髓穿刺针抽取胫骨骨髓4-6ml离心后接种于培养瓶，待细胞达到70～80％贴壁融合后进行传代，用倒置显微镜观察原代及传代细胞形态。
　　②绘制细胞生长曲线:将生长良好第三代BMSCs配制成1.0×104/ml的BMSCs细胞悬液，并接种子24孔培养板内，每天取出一组进行计数，每组设3复孔，连续观察10天后绘制细胞的生长曲线。
　　③PRP的制备:取同一只新西兰大白兔，经耳缘静脉麻醉，分离颈总动脉并抽取全血，采用二次离心法分离兔全血并制备PRP，并在检验室检测所制备PRP和兔全血血小板数目。新鲜获取的PRP以牛凝血酶激活后，立即加入到细胞培养系中。
　　④实验分组:实验组加入含20％PRP的含矿化诱导液的无血清完全DMEM培养液:对照组加入不含PRP的含矿化诱导液的无血清完全DMEM培养液。每组设3复孔。
　　⑤成骨细胞的鉴定:取第3代生长良好的BMSCs用成骨诱导培养液进行培养后，以碱性磷酸酶染色法及钙结节茜素红染色法验证其具有成骨分化能力。
　　⑥成骨细胞增殖检测:应用MTT法分别检测第1、4、7、10d实验组和对照组中成骨细胞的增殖情况，其中每组设定3个复孔。
　　⑦成骨细胞碱性磷酸酶活性检测:应用碱性磷酸酶检测试剂盒分别检测第4、7、10、14d实验组和对照组细胞中碱性磷酸酶的含量，每组设定3个复孔。
　　⑧成骨细胞骨涎蛋白表达检测:通过蛋白质印迹法(Western-blot)分别检测第4、9、14、19、24d实验组和对照组中成骨细胞骨涎蛋白的表达情况。
　　结果:
　　①BMSCs细胞形态学观察:原代培养5d后，细胞呈短梭形、梭形、三角形或多角形，多个细胞聚集成集落，呈散在分布，随着培养时间的延长，细胞数目明显增多，11-12d左右，可见细胞铺满瓶底的80-90％，贴壁细胞呈长梭形、纺锤形排列，紧密排列类似集束状、漩涡状，传代后的细胞增殖速度明显加快，传3代以后细胞形态较为均一，细胞数量增多，形态呈现长梭形或者纺锤体样，细胞整体呈鱼群样、漩涡状或平行排列。细胞的生长曲线显示:1-2d为潜伏期，细胞增殖不明显，3d后细胞增殖明显加快，进入对数生长期，7d后增殖变慢为平台期，之后细胞数目趋于平缓。
　　②成骨细胞的鉴定:经成骨诱导后，碱性磷酸酶染色和钙结节茜素红染色结果均呈阳性表达，表明所培养的BMSCs可以体外诱导为成骨细胞，并具有矿化能力。
　　③PRP的检测:PRP中的血小板数目为855±27×109/L，全血中血小板数目为203±33×109/L，PRP中血小板数目为全血的4.2倍，符合实验要求。
　　④MTT检测增殖结果:实验组各时间点均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且在第7d时实验组获得最高OD值，对照组各时间点之间无明显变化。
　　⑤碱性磷酸酶活性检测:实验组各时间点均明显高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，且在第10d时实验组获得最高OD值，对照组各时间点之间无明显变化。
　　⑥Western blot检测骨涎蛋白的表达水平:实验组各检测时间点的灰度值均高于对照组，差异具有统计学意义(P＜0.05)，第19d时实验组灰度值最高。
　　结论:
　　①兔BMSCs在体外可诱导为成骨细胞。
　　②采用二次离心法可制备出高浓度的富血小板血浆，在体外能够促进兔成骨细胞的增殖和分化。增殖作用最强在PRP作用第7d，分化能力最强在PRP作用第10d。
　　③自体PRP能够促进成骨细胞中骨涎蛋白的表达，且第19d表达水平最高。推测PRP能够通过促进骨涎蛋白表达而发挥其促进成骨的作用。

目录

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摘要

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 骨涎蛋白在成骨过程中的作用及影响因素

致谢

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