空肠弯曲菌灌胃经小鼠消化道排出后毒力及致周围神经病变能力变化的研究

摘要

目的:研究不同来源的空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni，Cj)经过连续多批小鼠灌胃消化道排出后，与原代空肠弯曲菌相比，其各分离变异株间生长繁殖能力、革兰染色形态变化等毒力的不同;同时进一步观察分析空肠弯曲菌分离变异株间致周围神经病变能力的差异，为了解认识在消化道环境中空肠弯曲菌毒力改变及不同毒力的空肠弯曲菌致周围神经病变能力的差异奠定基础。
　　方法:
　　1.复苏培养原代空肠弯曲菌:选择河北医科大学第二医院神经内科实验室-80℃冰箱中冻存的，分离自急性运动性轴索型（AMAN型）吉兰-巴雷综合征(Guillain-Barresyndrome，GBS)患者粪便中的空肠弯曲菌lulei株和分离自单纯细菌性腹泻患者粪便中的空肠弯曲菌NCTC11168株。将它们于室温溶化后，取500ul菌液倒入乘有5ml灭菌布氏肉汤培养基的洁净西林瓶中，置于三气培养箱中，在42℃微需氧(10％CO2、5％O2、85％N2)环境下增菌24小时，后传代至含7％脱纤维羊血的哥伦比亚血平板培养基上，于相同环境条件下培养24小时，以同样方法传代至第3代，成功复苏空肠弯曲菌。
　　2.空肠弯曲菌的鉴定:采用革兰染色和马尿酸钠水解试验的方法鉴定空肠弯曲菌。
　　3.实验动物的选择和分组方法:选用4周龄，体重18-20g，雄性清洁级健康昆明小鼠。共分为9个批次，每一批次3组，分别为lulei株组、NCTC11168株组和布氏肉汤对照组，每一组2只小鼠，共54只小鼠。
　　4.给菌方法和浓度:实验组小鼠经口灌胃3×108cfu/ml浓度的活菌菌悬液0.5ml;对照组小鼠灌胃灭菌布氏肉汤0.5ml，所有小鼠灌喂前均禁食水12小时，灌胃后立即给予食水。
　　5.空肠弯曲菌分离培养:将原代空肠弯曲菌lulei株和NCTC11168株灌胃第一批次小鼠，共灌胃2次，间隔24小时，分别于灌胃后48小时和72小时采集小鼠粪便，并从粪便中分离纯化上述2个时间点的空肠弯曲菌分离变异株。将分离纯化得到的72小时空肠弯曲菌lulei分离变异株和NCTC11168分离变异株分别灌胃第二批次小鼠，以此类推，直至完成9个批次空肠弯曲菌的分离培养。
　　6.不同批次相同时间点，空肠弯曲菌分离变异株间生长繁殖能力及革兰染色形态变化观察:细菌的生长繁殖能力是评价细菌毒力的重要指标，分别采用平板菌落计数法和革兰染色的方法比较各空肠弯曲菌分离变异株间生长繁殖能力及革兰染色形态变化的差异。
　　7.实验动物一般情况的观察:自灌胃当日起每天观察小鼠的状态:如进食水情况、精神状态、大便性状、皮毛光滑程度、体重及肢体活动情况等，一般观察时间为30天，之后处死解剖动物，取双侧坐骨神经进行神经病理观察，如动物在30天内出现明显瘫痪症状，随时解剖取材病理观察。
　　8.不同批次小鼠周围神经病理学检查:采用HE染色、免疫组织化学染色、锇酸染色、甲苯胺蓝染色和透射电子显微镜的方法观察不同批次小鼠周围神经病理变化。
　　结果:
　　1.不同批次空肠弯曲菌分离变异株间单位时间内生长繁殖速度不同，各批次相同采集粪便的时间点分离得到的变异株，随着批次的增加空肠弯曲菌生长繁殖能力逐渐增强，且呈现出非线性增强的趋势。
　　2.不同批次空肠弯曲菌分离变异株间革兰染色镜检观察，形态发生变化。随着批次增加，空肠弯曲菌lulei分离变异株菌体逐渐变长、变细，螺旋杆状或弯曲杆状程度逐渐明显，呈双“S”形或三“S”形;空肠弯曲菌NCTC11168分离变异株间菌体逐渐变短，存在由“直杆状”向“C”形变化的趋势。
　　3.小鼠一般情况的观察:第7批次lulei组1只小鼠于灌胃后72小时出现明显双侧后肢完全瘫痪症状，完全依靠前肢拖拽活动，活动能力差，进食水少，精神状态不佳，毛竖起，体重无明显减轻，大便性状无明显改变，余实验组和对照组小鼠在灌胃后30天解剖时活动能力及进食水情况如常，精神状态好，体重无明显减轻。
　　4.小鼠周围神经病理学观察:第7批次lulei组1只瘫痪小鼠坐骨神经出现明显病理学改变，表现为:HE染色可见轴索粗细不均，表面不光滑，部分断裂。免疫组织化学染色可见髓鞘断裂消失;轴索粗细不均、断裂。锇酸染色可见脱髓鞘表现，神经髓鞘回缩，呈“城墙样”改变，在郎飞氏节附近髓鞘回缩明显;同时在郎飞氏节附近可见髓鞘再生。甲苯胺蓝染色可见髓鞘脱落、断裂，部分髓鞘向轴索方向脱落压迫轴索，同时可见髓鞘再生，轴索出现华勒样变性。透射电子显微镜观察，可见线粒体脊消失，线粒体外膜肿胀;轴索膜与髓鞘膜分离，髓鞘板层结构消失，呈同心圆样向轴索方向回缩，压迫轴索。余实验组及对照组小鼠在灌胃30天后解剖取坐骨神经，采用上述方法观察病理学改变，表现为髓鞘及轴索光滑完整，未见神经病理学变化。
　　结论:
　　1.不同来源的空肠弯曲菌lulei株和NCTC11168株经连续多批次小鼠灌胃消化道分离后，相同采集粪便时间点得到的变异株间生长繁殖能力随着批次增加逐渐增强，且增强趋势为非线性。空肠弯曲菌分离变异株间革兰染色镜检细菌形态出现连续性变化。说明空肠弯曲菌在经过小鼠消化道排出体外后毒力增强，且这种增强趋势为非线性，空肠弯曲菌的形态在消化道环境影响下发生连续改变。
　　2.不同毒力的空肠弯曲菌连续2次小鼠灌胃后，未出现明显腹泻症状，但可以出现类似吉兰-巴雷综合征的瘫痪症状和周围神经病理改变。说明空肠弯曲菌在消化道环境中毒力增强不足以导致小鼠腹泻症状的发生。虽然空肠弯曲菌与吉兰-巴雷综合症间关系密切，然而，伴随空肠弯曲菌毒力增强，其导致小鼠瘫痪症状及周围神经病理改变的能力未出现同步加强，说明拟通过使用经小鼠消化道后毒力加强的空肠弯曲菌2次口服灌胃实验小鼠的方法，不能达到建立稳定的类似吉兰-巴雷综合征临床和周围神经病变动物模型的能力。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 空肠弯曲菌复苏培养鉴定及活菌菌悬液的制备

2 小鼠饲养观察及空肠弯曲菌小鼠体内培养方式

3 各批次小鼠粪便中空肠弯曲菌分离培养、鉴定

4 小鼠解剖和取材

5 坐骨神经病理学观察

6．细菌平板菌落计数方法

结果

1．各批次相同采集粪便时间点分离得到的空肠弯曲菌分离株生长繁殖能力的比较

2．空肠弯曲菌各分离株形态变化

3 昆明小鼠临床症状观察

4 坐骨神经病理学观察

附图

讨论

结论

参考文献

综述 空肠弯曲菌、吉兰-巴雷综合征及其关系研究进展

致谢

个人简历