基于中空纤维的样品前处理技术及分离分析方法的开发与应用

摘要

随着科学技术的迅猛发展，现代仪器分析的灵敏度、特异性已经大大提高，但在药物分析中，样品仍然需要进行适当的前处理，其占用的分析时间少则几分钟，有些甚至几十分钟或更长;样品的前处理时间可占整个分析时间的三分之二以上。因此，样品前处理技术在药物分析方法中有着举足轻重的作用。样品前处理技术的先进与否，直接关系到分析方法的优劣。发展省时高效、有机溶剂消耗少和集萃取、分离纯化、浓缩富集、进样于一体的新型样品前处理技术，已成为药物分析研究的热点领域之一。
　　以中空纤维(Hollow Fiber，HF)为载体的样品前处理技术近几年有了飞快的发展。HF是一种有一定大小孔径、起分子筛作用的半透性膜形成的空心细管，HF膜具有选择透过性，可以使液体、气体混合物中某些组分从外向内腔或从内腔向外透过HF膜壁。HF优异的结构特点使其成为目前样品前处理技术研究的热点。
　　中空纤维液相微萃取(Hollow Fiber Liquid-Phase Microextraction，HF-LPME)因其具有集分离纯化、富集浓缩、进样于一体的优点，在环境科学中具有广泛的应用。同样HF-LPME在药物分析中也得到了广泛的应用。随着人们对药品质量要求的提高，药品生产企业普遍采用了GMP管理模式，对企业设备清洁效率和管理提出了更高的要求。清洁后残留物分析的灵敏度是清洗验证的重要环节，是评价设备清洁效率的关键。本课题将HF-LPME作为设备清洗验证中分析方法的样品前处理技术，一步实现了样品的分离、纯化和富集，富集倍数达到两个数量级，极大地提高了分析方法的灵敏度，简化了实验操作，使得清洁验证的评价更加科学、可靠。
　　HF优异的超滤性能使其在生物制药、基因工程、血液透析等领域技术中广泛应用。HF对大分子物质的截留作用也使其在分析样品前处理中得到了迅猛发展。本课题利用中空纤维对大分子物质的截留作用，开发了一种从脂质体中分离未包封药物（即游离药物）的中空纤维离心超滤技术(Hollow Fiber Centrifugal Ultrafiltration，HF-CF-UF)，并将HF-CF-UF技术成功地应用于维生素A脂质体及难溶性药物两性霉素B脂质体的包封率测定。方法的分离过程基本保持了脂质体处方的原始的、稳定的存在环境（物理化学环境），最大限度的减少了脂质体的泄露。课题比较了传统测定包封率的方法如凝胶色谱法(SEC)、固相萃取法(SPE)及离心超滤法(CF-UF)的方法特点。研究结果表明，HF-CF-UF不仅测定结果失真小，重现性好;而且操作简单，仅需一步离心即可有效的分离游离药物;而SEC、SPE不仅受到洗脱液物理化学环境与原脂质体基质不同，从而影响脂质体的稳定状态，且还受到洗脱液的断洗脱的影响，对脂质体的稳定状态影响较大，甚至导致游离药物浓度增加，测定结果失真。课题进一步探索了传统方法在测定脂质体包封率过程中出现的某些弊端的原因，为CF-UF分析表征脂质体包封率提供了理论依据。
　　综上所述，以HF为载体的LPME的样品前处理技术不仅具有分离纯化功能，具有较高的富集效率，且操作简便、能有效避免交叉污染等突出优点，减少了繁杂操作带来的误差，特别适用于生产现场痕量组分的检测。以HF为载体的HF-CF-UF方法检测脂质体包封率，方法简单，分离过程保持了脂质体原始状态，方法失真小，且由于测定溶液没有稀释，测定误差小，重现性好。
　　第一部分中空纤维液液微萃取技术在痕量药物分析中的研究与应用
　　一中空纤维液液微萃取-HPLC法测定马钱子碱及士的宁清洁残留物
　　目的:建立中空纤维两相液液微萃取(HF-LPME-HPLC)法，检测设备清洁验证中痕量士的宁和马钱子碱。
　　方法:首先采用HF-LPME对样品进行纯化富集，其分离富集条件为:以正辛醇作为萃取溶剂，在800 r/min搅拌速度下常温萃取60 min。萃取后萃取溶液直接进样HPLC分析，色谱分析条件为:流动相为乙腈-0.4％磷酸水溶液(三乙胺调pH3.0)=13∶87;流速1.0 mL/min;检测波长260 nm。
　　结果:在优化的条件下，士的宁和马钱子碱富集倍数分别为120倍和80倍。士的宁在19.0 ng/mL～1.90μg/mL之间线性关系良好（r2为0.9941），最低检出限为2.98 ng/mL，回收率为95.0％，RSD为5.1％;马钱子碱在11.0ng/mL～1.10μg/mL之间线性关系良好(r2为0.9948)，最低检出限为2.75ng/mL，回收率为98.6％，RSD为0.8％。
　　结论:所建立的HF-LPME方法将样品中士的宁和马钱子碱的富集两个数量级，使其检测灵敏度大大提高，使清洁验证的评价更加科学、可靠。此外，该样品前处理方法操作简单快速、成本低、且环境友好，适用于生产现场清洁设备和容器中士的宁和马钱子碱残留的检测，为清洁验证评价中痕量药物残留的检测提供一种新的手段。
　　二中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法同时检测清洁过程中的4种痕量二氢吡啶类药物的残留
　　目的:建立HF-LPME-HPLC法，用于设备清洁中4种二氢吡啶类药物（尼群地平、尼莫地平、费乐地平、间尼索地平）残留量的测定。
　　方法:首先采用HF-LPME装置对样品进行纯化富集，萃取条件为:正辛醇为接受相，水为供给相，搅拌速度为800 r/min，常温下萃取时间为80 min。色谱分析条件采用Kromasil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5μm);流动相:乙腈-水(60∶40，v/v);流速:1.0 mL/min;检测波长:237 nm。
　　结果:在优化的萃取条件下，尼群地平、尼莫地平、费乐地平的富集倍数达120倍左右，间尼索地平的富集倍数约为100倍。四种药物均在10～2.0×103μg/mL范围内线性关系良好，r2范围为0.9900～0.9982，平均回收率为93.0％～99.7％(RSD不高于4.0％)。
　　结论:HF-LPME集分离纯化、浓缩富集、进样于一体，四种残留物的富集倍数均达到两个数量级，极大地提高了四种残留物分析方法的灵敏度。同时HF-LPME技术极大地简化了试验操作;且有机溶剂用量少，环境友好，可以用于企业的生产现场检测，为清洁验证过程中二氢吡啶类药物的痕量检测提供一种新的手段。
　　第二部分中空纤维离心超滤法在脂质体质量表征中的应用
　　一中空纤维离心超滤-HPLC法测定注射用两性霉素B脂质体的包封率
　　目的:建立HF-CF-UF分离脂质体中未包封药物的前处理方法，并结合HPLC用于注射用两性霉素B脂质体的包封率的表征。
　　方法:采用HF-CF-UF将未包封药物从脂质体中分离出来。取两性霉素B脂质体约0.2 mL，置离心管中，将PSU膜材的中空纤维弯成U型后插入该管，置离心机中。在6000 r/min条件下离心15 min后打出超滤液直接注入色谱系统，测定未包封药物浓度。另取两性霉素B脂质体适量破乳后分析测定总药物浓度，并计算包封率。色谱分析采用Diamonsil C18色谱柱(250 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈-0.02 mol/L Na2EDTA(38∶62)，流速:1.0 mL/min，检测波长:405 nm，柱温为常温。
　　结果:HF-CF-UF方法仅需一步离心即可有效的将未包封的药物从脂质体中分离出来，且超滤液可以直接注入HPLC进行分析。两性霉素B在0.67～21.4μg/mL范围内线性关系良好（r2=0.9997），回收率均在97％以上，RSD不大于2％。三批样品所测得的包封率分别为99.3％，99.6％，98.9％，RSD不大于1％。
　　结论:本方法所用样品体积小，基本保持了脂质体处方的原始、稳定的存在环境（物理化学环境），最大限度地减少了脂质体的泄露，结果准确且简便快速，为脂质体包封率的表征提供了一种新方法。
　　二中空纤维离心超滤-HPLC法测定维生素A脂质体的包封率
　　目的:建立HF-CF-UF分离脂质体中未包封药物的前处理方法，并结合HPLC法用于维生素A脂质体的包封率的表征。
　　方法:取维生素A脂质体约0.2 mL，置离心管中，将用维生素C棕榈酸酯溶液饱和的中空纤维弯成U型后插入该管，置离心机中。在4000r/min条件下离心15 min后打出超滤液直接注入色谱系统，测定未包封药物浓度。另取维生素A脂质体加甲醇破乳后分析测定总药物浓度，并计算包封率。色谱分析采用Diamonsil C18色谱柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为纯甲醇，流速:1.0 mL/min，检测波长:325 nm。
　　结果:试验结果表明，HF-CF-UF方法仅需一步离心即可有效的将未包封的药物从脂质体中分离出来，且超滤液可以直接注入HPLC进行分析。维生素A在0.258～8.24μg/mL范围内线性关系良好，回收率均在97.7％以上，RSD不大于1.5％。测得的三批维生素A脂质体包封率分别为98.8％，98.4％，98.9％，RSD不大于0.5％。
　　结论:本方法操作简便，不破坏脂质体稳定的存在环境，克服了传统方法存在的某些弊端，结果准确，为脂质体包封率的表征提供了一种新方法。
　　第三部分中空纤维离心超滤法在脂质体质量表征中的理论研究
　　目的:将HF-CF-UF与传统的测定包封率的方法进行比较的基础上，提出了包封率测定过程中的动态平衡理论，并阐述了吸附现象的存在对难溶性药物制备的脂质体的包封率测定的影响，为脂质体质量表征时方法的选择提供了理论指导。
　　方法:分别采用SEC、SPE、CF-UF及HF-CF-UF对维生素A脂质体和难溶性药物注射用两性霉素B脂质体进行包封率的测定。比较几种方法测得的差异，并进一步探索其原因。在SEC中，采用二次洗脱的方法，通过测定游离药物的浓度以阐述包封率测定结果偏低的原因。采用拆方分析法，测定脂质体处方中稳定剂在SPE柱的回收率，说明吸附现象对难溶性药物两性霉素B脂质体包封率测定结果的影响。
　　结果:通过比较测定，SEC所测得的数值要比HF-CF-UF的数值低3％左右，通过进一步研究表明，SEC在测定过程中存在凝胶对脂质体的吸附现象及洗脱液导致脂质体渗漏的出现;选用SPE测定时，固定相填料的选择对测定具有重大影响，填料的疏水性作用易对AmB脂质体处方中的胆固醇和去氧胆酸钠产生吸附作用使得其不能被洗脱;而CF-UF中，除了浓差极化限制了其应用外，非特异性吸附也是不可忽视的。
　　结论:HF-CF-UF避免了洗脱液的稀释作用，最大限度的保持了脂质体的存在状态，未包封的游离药物能自由穿过中空纤维膜，适合于脂质体中未包封的游离药物的分离测定。然而，传统的测定包封率的方法则操作繁琐费时，易受洗脱液、吸附现象的影响使得脂质体表征失真。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 中空纤维两相微萃取技术在痕量药物分析中的研究

一 中空纤维液液微萃取-HPLC法测定马钱子碱及士的宁清洁残留物

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

二 中空纤维液相微萃取-高效液相色谱法同时测定清洁验证过程中的4种痕量二氢吡啶类药物

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 中空纤维离心超滤法在脂质体质量表征中的应用

一 中空纤维离心超滤-HPLC法测定注射用两性霉素B脂质体的包封率

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

二 中空纤维离心超滤-HPLC法测定维生素A脂质体的包封率

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 中空纤维离心超滤法在脂质体质量表征中的理论研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 脂质体包封率测定方法的研究进展

致谢

个人简历