缺氧缺血性脑病新生大鼠肾脏Bax和Caspase-3蛋白的表达与肾细胞凋亡的作用机制

摘要

目的:新生儿缺氧缺血性脑病(hypoxic-ischemic encephalopathy，HIE)是指在围产期缺氧窒息，导致脑的缺氧缺血性损害。是新生儿常见疾病，是新生儿死亡或运动、智力障碍的常见原因。HIE除脑组织缺氧缺血性损伤外，全身多器官均有损伤，其中，肾脏为损伤的重要脏器之一。目前，人们对HIE造成的脑损伤研究报道较多，而对HIE发生后肾脏损伤研究较少，凋亡相关基因的表达对肾细胞凋亡的影响鲜有报道。本课题通过应用Annexin-V标记流式细胞术检测肾细胞凋亡情况;应用免疫组织化学法检测肾细胞Bax和Caspase-3蛋白的表达情况;ELISA法检测肾组织中TNF-α、 IL-1β的表达;应用Western blot技术检测肾细胞凋亡与P38MAPK信号通路的关系，探讨HIE新生儿肾脏损伤的发生机制，旨在阐明对于HIE的患者，早期诊断，早期治疗有着重要意义，还为探讨在缺氧缺血状态下，所致肾脏细胞损伤的分子机制提供实验依据。
　　方法:
　　1.构建HIE动物模型将新生7 d Wistar大鼠随机分为假手术对照组和HIE组。假手术对照组只予分离左侧颈总动脉，不结扎动脉，缝合皮肤;HIE组分离并结扎左侧颈总动脉，缝合皮肤，术后放回鼠笼恢复2h。随后，置于密闭玻璃器皿中，以湿化的8％氧气和92％氮气的混合气体输入玻璃器皿中，持续3-4h制成新生大鼠HIE动物模型[4]。
　　2.流式细胞技术测定肾细胞凋亡收集肾细胞，预冷PBS洗涤2次，悬浮细胞，调整细胞个数为1×106cells/ml，按照BD试剂盒说明书步骤完成Annexin V-FITC/PI双染色后，PBS洗涤后，立刻上机检测。
　　3.免疫组化检测Bax和Caspase-3蛋白的表达肾脏石蜡包埋组织切片经脱蜡、水化、抗原修复,加3％H2O2阻断内源性过氧化物酶，加一抗（Bax和Caspase-3单抗），室温孵育1h，加试剂A-聚合物增强剂，室温孵育20min,加试剂B-酶标抗鼠/兔聚合物，室温孵育30min，再经DAB显色，苏木素衬染，脱水干燥，中性树脂封片。显微镜先观察。
　　4.ELISA检测TNF-α、IL-1β细胞因子将肾皮质用剪刀剪碎再用玻璃匀浆器充分匀浆，12000rpm，4度，离心30分钟后取上清，TNF-α、IL-1β浓度的检测采用ELISA法，具体操作根据试剂盒说明书进行。
　　5.Western blot检测P38MAPK信号通路情况将肾脏用剪刀剪碎，按照蛋白抽提试剂盒说明加入试剂，再用玻璃匀浆器充分匀浆。12000rpm，4度，离心30分钟后取上清，取上清液后进行蛋白定量。制备的蛋白样品进行10％SDS-PAGE电泳分离，再以400mA恒流电转印到PVDF膜上，5％脱脂奶粉室温封闭1h，再加入一抗4℃孵育过夜，次日TBS-T洗涤3次，10min/次，加入辣根酶标记的二抗室温孵育1h，再TBS-T洗涤3次，10min/次，ECL化学发光剂发光检测信号。
　　结果:
　　1.大鼠肾细胞凋亡的情况对照组阳性凋亡细胞为2.75％，HIE组6h肾脏阳性凋亡细胞升高到5.46％，24h达到35.27％，HIE组各时间点阳性凋亡细胞仍高于对照组(P＜0.05)。
　　2.大鼠肾脏组织Bax和Caspase-3免疫组化情况HIE组Bax和Caspase-3表达量明显升高，可见大量的强阳性棕褐色颗粒，而对照组中Bax和Caspase-3的表达极低，几乎看不到棕褐色颗粒.
　　Bax:6h、12h、24h、48h时，HIE组(分别为190.43±6.56、176.90±4.69、132.81±5.73、156.34±5.89)与假手术对照组(224.49±8.34)相比，均显著升高（均P＜0.05），在HIE后24小时Bax表达达到高峰。
　　Caspase:6h、12h、24h、48h时，HIE组(分别为190.42±8.31、187.866±6.31、95.58±11.58、179.20±5.41)与假手术对照组（为195.71±13.71）相比，均显著升高（均P＜0.05），在HIE后24小时Caspase-3表达达到高峰。
　　3.肾组织TNF-α、IL-1β含量水平的变化HIE组6h TNF-α、IL-1β含量开始增多，分别为23.1±1.1 ng/L2.0±0.1 ng/L，TNF-α12h达到高峰，为30.3±1.53 ng/L，IL-1β24h达到高峰为3.1±0.15 ng/L，HIE组各时间点TNF-α、IL-1β的表达均高于对照组(19.3±1.53 ng/L1.67±0.06 ng/L)，(P＜0.05)，差异有统计学意义。
　　4.肾组织p-p38MAPK信号通路的变化HIE组p-p38MAPK蛋白表达均高于对照组，差异显著(P＜0.05)，其中HIE组中，6小时p-p38MAPK表达明显高于其他时间段，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1.成功构建了HIE大鼠动物模型;
　　2.HIE发生后诱导肾细胞发生凋亡;
　　3.HIE发生后诱导肾细胞促炎症因子分泌增加;
　　4.HIE发生后肾细胞Bax和Caspase-3蛋白的表达增加;
　　5.HIE发生后诱导肾细胞凋亡是通过P38MAPK信号通路实现的

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 实验材料与仪器

2 方法

结果

1 流式细胞术检测各组大鼠肾细胞凋亡的情况

2 各组大鼠肾脏组织Bax和Caspase-3免疫组化染色结果比较

3 ELISA测定TNF-α、IL-1β分泌水平的变化

4 Western blot测定p-p38MAPK信号通路的变化

附表

附图

讨论

结论

参考文献

综述 HIE的概述及相关研究进展

致谢

个人简历