脐带血CD34+细胞来源的树突状细胞功能活性研究

摘要

目的:探讨脐带血CD34+细胞来源的树突状细胞(dendritic cell，DC)的大量体外扩增、培养方法，并鉴定扩增后树突状细胞的生物学特征、活性及介导的杀伤细胞抗肿瘤效应。
　　方法:收集健康足月产妇的新鲜脐带血，用淋巴细胞分离液分离出单个核细胞，利用CD34+磁珠进行阳性分选，然后将CD34+细胞接种到含有粒细胞巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)和干细胞因子(SCF)的培养基中连续培养30天，并计数细胞量。在培养过程中，收集第14天的部分细胞，加入到含有GM-CSF、白介素-4(IL-4)细胞因子的培养基中，诱导分化为未成熟DC。利用倒置显微镜对所诱导的DC细胞每日进行形态学观察，并分别于第1、3、5天利用流式细胞术(FCM)检测DC细胞的表面分子CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率及利用FITC-右旋糖苷实验检测DC吞噬能力。然后取培养第5天的未成熟DC细胞负载LST-174、paca肿瘤全抗原（肿瘤细胞裂解物），同时加入TNF-a，2天后经流式细胞术检测负载肿瘤全抗原的DC细胞表面分子CD80、CD83、CD86、HLA-DR表达率。
　　利用人淋巴细胞分离液分离外周血，得到外周血T淋巴细胞，经含有IL-2的培养基继续培养扩增。在含GM-CSF、IL-4的培养基培养过程中，分别将第5天的未成熟DC细胞（负载抗原前）和培养第7天的成熟DC细胞（负载抗原2天）与T淋巴细胞混合培养24小时，用CCK-8试剂盒检测DC混合T淋巴细胞反应。将培养第7天的DC细胞（负载抗原2天）与T淋巴细胞混合培养2天，制备抗原特异性CTL，将CTL加入到96孔板中的LST-174、paca肿瘤细胞混合孵育24小时，同时设立空白对照、靶细胞对照、效应细胞对照组，利用CCK-8检测DC介导的细胞毒性T淋巴细胞对两种肿瘤细胞的杀伤效应。
　　结果:1.可从50ml脐带血中平均分离约1.35*106个CD34+细胞，经30天连续培养，细胞数量由初始量平均扩增至1.47*1011个，平均扩增约109701倍;
　　2.在30天的培养过程中，选择了第14天的细胞加入含GM-CSF、IL-4的培养基继续培养一周，细胞贴壁并具有典型的DC细胞形态。在培养第1、3、5天用流式细胞术分别检测CD34+来源的DC表面分子CD80表达率分别为3.70±0.65％、14.53±0.97％、44.27±4.78％; CD83表达率分别为11.47±1.22％、40.70±3.73％、53.50±2.21％; CD86表达率分别为49.97±4.83％、71.37±2.66％、74.80±3.89％; HLA-DR表达率分别为45.53±1.84％、71.33±4.32％、74.80±4.53％。第7天（负载抗原后2天）的DC，经流式细胞术检测DC表面分子CD80表达率为92.06±1.92％，表面分子CD83表达率92.07±2.09％，表面分子CD86表达率94.43±1.67％，表面分子HLA-DR表达率87.80±3.37％
　　3.在培养第1、3、5天用流式细胞术检测CD34+来源的DC的吞噬能力，30分钟结果分别为61.83±4.10％、69.07±2.63％、75.87±2.49％;60分钟结果分别为60.73±2.68％、72.13±1.68％、78.97±2.41％。
　　4.在培养第5天，检测CD34+来源的DC（负载抗原前）和第7天（负载抗原后2天）的DC的混合T淋巴细胞反应，设置的E∶T=1∶1、1∶2、1∶5、1∶10、1∶20、1∶40的6个不同比例均有对淋巴细胞的促增殖作用，其中1∶1、1∶2组促增殖作用最强，而1∶40组促增殖作用最弱。而负载抗原的成熟DC组的促增殖作用均高于未成熟DC组。
　　5.在培养第五天，制备肿瘤抗原负载的DC疫苗，激活T细胞生成CTL，对肿瘤细胞LST-174、paca在不同效靶比下均有杀伤作用，其中在40∶1效靶比下，杀瘤效率最高，LST-174组为64.33±1.14％，paca组为76.17±0.87％，随着效靶比浓度下降，杀瘤效率降低，在1∶1效靶比下杀瘤效率最低，LST-174组为13.23±0.48％，paca组为20.03±1.16％。
　　结论:1.经GM-CSF/SCF联合应用可诱导脐带血CD34+细胞生成大量前体DC细胞，并将前体DC细胞平均扩增可达105倍。
　　2.扩增后的脐带血CD34+来源的DC前体细胞可诱导分化为典型的未成熟DC细胞，培养第5天后其吞噬能力最强，最适合负载抗原;DC混合T淋巴细胞反应显示促增殖作用显著，表面分子CD80，CD83，CD86，HLA-DR表达率较高，是最理想的负载抗原、制备DC疫苗的时机。
　　3.负载LST-174、paca肿瘤全抗原的成熟DC诱导产生的CTL对两种肿瘤细胞具有特异性杀伤作用。提示扩增之后的DC细胞制备的DC疫苗激活机体抗肿瘤免疫是可行和有效的。

目录

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摘要

英文缩写

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 树突状细胞和脐带血来源的树突状细胞的研究进展

致谢

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