两种中成药化学成分的HPLC-MS/MS定量分析

摘要

中成药是以中药为原料，根据中医药理论配伍、组方，按一定制备工艺和方法制成的剂型。其成分复杂、多变，对其化学成分的分析应采用专属性好、灵敏度好的方法。液质联用技术(HPLC-MS)兼具液相色谱的分离功能和质谱的结构分析功能，具有高专属性、高灵敏度等优势，尤其适合复杂体系的分析。本研究即以两种中药复方制剂清火栀麦片和芩连片为研究对象，探索HPLC-MS/MS技术在中成药复杂体系中，同时定量分析其多种化学成分的应用。
　　第一部分 HPLC-MS/MS技术测定芩连片中10种化学成分
　　目的:建立使用HPLC-MS/MS技术定量芩连片中10种化学成分的方法，并用该方法对芩连片进行质量控制。
　　方法:采用多反应监测(MRM)模式监测芩连片中10种化学成分，ESI源，正负离子切换模式，源喷射电压分别为5500和-4500V，离子源温度为650℃。本实验分别对质谱条件，色谱条件和样品的提取条件进行了考察。质谱条件:单一对照品进行针泵进样，在Q1全扫描模式下寻找响应值最高的母离子，并在Product ion mode模式下寻找该母离子的子离子，并对DP和CE电压进行优化。色谱条件:本研究考察了流动相中加入的甲酸和乙酸铵的浓度(1 mmol/L，2mmol/L，4mmol/)对于峰响应值和峰形的影响。由于盐酸黄柏碱有明显的溶剂效应，故对稀释溶剂甲醇的浓度(5％，10％，20％)进行了考察。提取条件:分别对提取溶剂的种类(甲醇，70％甲醇，盐酸-甲醇(1∶100)，乙醇，70％乙醇）和超声时间(15 min，30 min，45 min，60 min)进行了考察。最终确定的条件为:色谱柱为C18柱，流动相为乙腈-水（含0.08％甲酸和2 mmol/L乙酸铵），梯度洗脱，分析时间15min，稀释溶剂为5％甲醇。芩连片样品采用2种提取溶剂盐酸-甲醇(1∶100)和70％乙醇分别提取4种生物碱和其余6种成分，提取时间为30 min。采用所建立的方法对5批芩连片中10种化学成分进行含量测定，并计算其批间RSD值。
　　结果:10种化学成分的峰面积与浓度在测定浓度范围内成良好的线性关系，定量限，精密度，准确度，仪器重复性，及溶液稳定性均符合要求，含量测定结果表明:不同批次的样品中，10种化学成分的含量有差异。连翘酯苷A和汉黄芩素的批间RSD值分别为41.6％和33.1％，黄连碱，巴马汀，盐酸小檗碱，甘草酸铵的RSD值小于10％，其余4种成分的RSD值在10％至30％之间。由于5批样品来自于同一厂家，故推测此种差异是由于药材的种植环境，采收季节以及储存环境的差异引起的。
　　结论:本法简便，快速，灵敏度高，专属性好，可用于芩连片中10种化学成分的含量测定，其中盐酸黄柏碱，甘草苷，甘草酸铵，连翘酯苷A及黄连碱均为芩连片中的首次测定。
　　第二部分 HPLC-MS/MS技术同时测定清火栀麦片中6种化学成分
　　清火栀麦片是一种常用的传统中药，本文建立了一种新的、专属的HPLC-MS/MS的方法，采用正负切换、MRM模式，同时测定清火栀麦片中主要的六种活性组分，栀子苷、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、麦冬皂苷D、甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B。色谱柱为Agilent Eclipse XDB-C18 column(150 mm×4.6 mm，5μm)，流动相为乙腈(A)和0.4‰乙酸-水(B)，梯度洗脱，分析时间15 min。标准曲线线性良好，在线性范围内，所有分析物的相关系数均大于0.9979。日内和日间精密度不大于7.0％，平均回收率在93.2％-108.5％之间，RSD小于等于5.4％。应用建立的方法成功的对5批清火栀麦片样品进行含量测定。这是首次测定清火栀麦片中麦冬皂苷D、甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量。
　　目的:建立HPLC-MS/MS方法同时测定清火栀麦片中6种化学成分栀子苷、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、麦冬皂苷D、甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B，并应用于清火栀麦片的质量控制。
　　方法:药材粉末用100％的甲醇超声提取1h。采用正负切换、MRM模式。同时测定清火栀麦片中主要的六种活性组分，栀子苷、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯、麦冬皂苷D、甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B。正负离子切换监测模式如下:0～9 min采用负离子模式，用于栀子苷、穿心莲内酯、脱水穿心莲内酯的测定，9～10.85 min采用正离子模式，用于麦冬皂苷D的测定，10.85～15 min采用负离子模式，用于甲基麦冬二氢高异黄酮A及甲基麦冬二氢高异黄酮B的测定。源喷射电压:5500/-4500 V;源温度(TEM):650℃;帘气(CUR):30 psi;雾化气(gas1):60 psi;加热气(gas2):65 psi，均为氮气。色谱柱为AgilentEclipse XDB-C18柱(150 mm×4.6 mm，5μm)，柱温:35℃。流动相为乙腈(A)和0.4‰乙酸-水(B)，梯度洗脱，洗脱程序如下:0～3 min，16％A;3～4 min,16％～60％A;4～10 min,60％A;10～12 min,60％～95％A;12～15min，95％A。分析时间15min。流速:0.8 ml/min。进样量:10μl。标准曲线线性良好，在线性范围内，所有分析物的相关系数均大于0.9979。日内和日间精密度不大于7.0％，平均回收率在93.2％-108.5％之间，RSD小于等于5.4％。应用建立的方法成功的对5批清火栀麦片样品进行含量测定。
　　结果:采用纯甲醇作溶剂，提取1h，可以将药材中的6种成分完全提取。在本实验中6种化学成分得到良好的分离，专属性良好。其峰面积和浓度在测定浓度范围内均具有良好的线性关系，标准曲线线性良好，在线性范围内，所有分析物的相关系数均大于0.9979。日内和日间精密度不大于7.0％，平均回收率在93.2％-108.5％之间，RSD小于等于5.4％。其中《中国药典》2010年版药典中规定的3种组分，栀子苷、穿心莲内酯和脱水穿心莲内酯均符合含量2010版中国药典的相关规定测定要求。而药典中未控制的麦冬中的组分含量差异较大。说明也需要对清火栀麦片中麦冬中的组分进行质量控制，以确保其质量的均一稳定。
　　结论:本法简便、快速、灵敏度高、专属性好，应用建立的方法成功的对5批清火栀麦片样品进行含量测定。这是首次测定清火栀麦片中麦冬皂苷D、甲基麦冬二氢高异黄酮A和甲基麦冬二氢高异黄酮B的含量。HPLC-MS的应用也为专属、有效的中药现代质量控制体系的建立提供了一个可行的方向。

目录

声明

摘要

引言

第一部分 HPLC-MS／MS技术测定芩连片中10种化学成分

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 LC-MS／MS技术同时测定清火栀麦片中6种化学成分

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述 液-质联用技术在中药研究工作中的应用

致谢

个人简历