三七总皂苷联合雷公藤多苷对胶原诱导关节炎大鼠心血管损伤的保护作用

摘要

目的:
　　类风湿关节炎(rheumatoid arthritis，RA)属于慢性、系统性、炎症性自身免疫性疾病。近年研究发现，心血管疾病在RA患者中的发病率、死亡率不断增高，已成为RA的首要死亡原因。因此探索RA合并心血管损伤的发病机理及防治措施已成为RA研究中亟待解决的重要问题之一。本课题拟在建立胶原诱导性关节炎(CIA)大鼠模型的基础上，通过观察三七总皂苷(PNS)联合雷公藤多苷(TG)对CIA大鼠模型外周血炎性细胞因子及心血管损伤相关因子，包括肿瘤坏死因子（tumor necrosisfactor-α，TNF-α）、白介素-6(interleukin-6，IL-6)、单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein1，MCP-Ⅰ)、纤溶酶原激活物抑制剂(Plasminogen Activator Inhibitor-1，PAI-1)、血管内皮生长因子(vascularendothelial growth factor, VEGF)水平，以及胸主动脉及心肌组织对MCP-1、VEGF表达的影响，探讨中药有效成分配伍对CIA大鼠心血管损伤的保护作用及其可能机制，为临床应用提供实验依据。
　　方法:
　　选择体重180-200g的Wistar大鼠，雌雄各半。电子天平称重，测量双侧足爪容积后，随机分为正常对照组和实验组（CIA造模组）。实验组大鼠于尾根部、右足跖及背部常规消毒后，皮内注射鸡Ⅱ型胶原共0.2ml/只，第14天实验组加强免疫一次，建立CIA模型。正常对照组用上述方法注入等量生理盐水。造模后第21天测量成模大鼠体重、双后足爪容积，计算关节炎指数(AI)，将成模大鼠随机分为模型组、雷公藤多苷组(TG)、TG+PNS、来氟米特组(LEF)，每组6只。正常对照组和模型组用生理盐水灌胃，其他组分别给予TG(10mg/kg)、TG+ PNS(10mg/kg+200mg/kg)、LEF(10mg/kg)灌胃治疗，共42d。灌胃第28d及第42d分别测量各组大鼠体重、双后足爪容积及关节炎指数，灌胃结束后第2天，用10％水合氯醛腹腔麻醉，腹主动脉取血，留取血清。应用液相蛋白芯片技术检测TNF-α、IL-6、MCP-1、PAI-1、VEGF含量。取血后立即打开胸腔，取出胸主动脉及心肌组织，分离周围脂肪及结缔组织，经固定、脱水、包埋、HE染色，免疫组织化学法检测胸主动脉及心肌组织MCP-1、VEGF的表达。
　　统计学处理:所有数据均采用SPSS for windows13.0软件进行统计学处理。计量资料正态分布数据用均数±标准差（(x)±s）表示，各组间均数比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05认为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1实验大鼠体重变化
　　造模前各组体重统计学无差异(P＞0.05)。造模后第21天，模型组、LEF组、TG组与TG+PNS组体重及体重增加值明显低于空白对照组(P＜0.01);但模型组、LEF组、TG组与TG+PNS组间无统计学差异(P＞0.05)。灌胃4周后，模型组、LEF组、TG组与TG+PNS组体重明显低于空白对照组(P＜0.01);模型组、LEF组、TG组与TG+PNS组间无统计学差异(P＞0.05)，但TG+PNS组体重增加值最大，与模型组相比有统计学差异(P＜0.05)。灌胃6周后，模型组、LEF组、TG组与TG+PNS组体重明显低于空白对照组（P＜0.01）;模型组、LEF组、TG组与TG+PNS组间无统计学差异(P＞0.05)，但TG+PNS组体重增加值最大，明显高于模型组（P＜0.01）、高于LEF组(P＜0.05)。
　　2各组大鼠双侧足爪肿胀率及抑制率的变化
　　给药4周后，LEF组、TG组与TG+PNS组造模侧（右）足爪平均肿胀率明显低于模型组(P＜0.01);LEF组、TG组与TG+PNS组间比较无统计学差异(P＞0.05)，但TG+PNS组对造模侧肿胀足爪的抑制率稍优于LEF及TG组(37.35％、30.16％、27.58％)。LEF组、TG组与TG+PNS组非造模侧平均肿胀率明显低于模型组(P＜0.01);LEF组、TG组与TG+PNS组间比较无统计学差异(P＞0.05)。给药后6周LEF组、TG组与TG+PNS组造模侧（右）足爪平均肿胀率明显低于模型组(P＜0.01);TG+PNS组肿胀率低于TG组，差异有统计学意义(P＜0.05);TG+PNS组与LEF组相比虽无统计学差异，但TG+PNS组抑制率优于LEF组(52.89％ VS46.65％)。LEF组、TG组与TG+PNS组非造模侧足爪平均肿胀率明显低于模型组(P＜0.01);TG+PNS组肿胀率低于TG组，差异有统计学意义(P＜0.05);TG+PNS组与LEF组相比，差异无统计学意义，TG+PNS组抑制率略优于LEF组(51.60％ VS44.10％)。
　　3各组大鼠关节炎指数(AI)的变化
　　造模后第21天，模型组、TG组、LEF组、TG+PNS组之间的AI差异无统计学意义（P＞0.05）;灌胃4周后，与模型组相比，TG组、LEF组、TG+PNS组AI差异显著(P＜0.01)，其中TG+PNS组AI最低，但与TG组差异无统计学意义(P＞0.05)。灌胃6周后，与模型组相比，TG组、LEF组、TG+PNS组AI差异显著(P＜0.01)，其中TG+PNS组平均AI最低。
　　4各组大鼠血清TNF-α、 IL-6、MCP-1、PAI-1、VEGF水平比较
　　各组TNF-α血清水平(pg/ml)比较结果:模型组、LEF组、TG组明显高于空白对照组，有统计学差异(P＜0.01);PNS+TG组高于空白组(P＜0.05);模型组明显高于LEF组、TG组、PNS+TG组，差异有统计学意义(P＜0.01); PNS+TG组与LEF组、TG组相比水平最低，有统计学差异（P＜0.05）。
　　各组IL-6血清水平(pg/ml)比较结果:模型组、LEF组、TG组明显高于空白对照组，有统计学差异(P＜0.01);PNS+TG组高于空白组(P＜0.05);模型组明显高于LEF组、TG组、PNS+TG组，差异有统计学意义(P＜0.01); PNS+TG组与LEF组、TG组相比水平最低，有统计学差异（P＜0.05）。
　　各组MCP-1血清水平(pg/ml)比较结果:模型组、LEF组、TG组明显高于空白对照组，有统计学差异(P＜0.01); PNS+TG组高于空白组(P＜0.05);模型组明显高于LEF组、TG组、PNS+TG组，差异有统计学意义(P＜0.01); PNS+TG组与LEF组、TG组相比水平最低，有统计学差异(P＜0.05)。
　　各组PAI-1血清水平(pg/ml)比较结果:模型组、LEF组、TG组明显高于空白对照组(P＜0.01); PNS+TG组高于空白组，差异有统计学意义(P＜0.05);模型组明显高于LEF组、TG组、PNS+TG组，有统计学差异（P＜0.01）;PNS+TG组与LEF组、TG组相比水平最低，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　各组VEGF血清水平(pg/ml)比较结果:模型组、LEF组、TG组明显高于空白对照组(P＜0.01); PNS+TG组高于空白组，差异有统计学意义（P＜0.05）;模型组明显高于LEF组、TG组、PNS+TG组（P＜0.01）;PNS+TG组与LEF组、TG组相比水平最低，差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　5各组大鼠胸主动脉、心肌病理变化和MCP-1、VEGF的表达
　　5.1各组大鼠胸主动脉及心肌病理变化
　　大鼠胸主动脉病理变化:模型组胸主动脉的内膜完整性差，可见泡沫细胞的形成，出现脂滴沉积，部分内膜平滑肌细胞之间的连接被细胞外脂滴破坏，属于动脉粥样硬化Ⅲ型改变;在LEF组、TG组中可见部分单核细胞增多、聚集，内膜内轻度脂质沉积，属于动脉粥样硬化Ⅰ型改变;PNS+TG组和空白对照组内皮显示完整，连续性相对较好，未见明显病理改变。大鼠心肌病理变化:模型组可见心肌广泛的炎性病变，部分心肌细胞间质水肿，心肌细胞间可见散在的淋巴细胞，心肌细胞内有局限性空泡变性;LEF组、TG组病变减轻，部分心肌细胞肥大及间质轻度水肿，局部炎性细胞聚集，并可见部分心肌细胞排列紊乱;PNS+TG组治疗效果最优，仅可见零星炎性细胞，空白对照组的心肌结构基本正常，心肌细胞未见明显异常变化。
　　5.2各组大鼠胸主动脉及心肌VEGF、MCP-1表达
　　胸主动脉中各组VEGF表达（以灰度值表示）:模型组、LEF组、TG组明显低于空白对照组（P＜0.01）;PNS+TG组低于空白组(P＜0.05);模型组明显低于LEF组、TG组、PNS+TG组，呈显著性统计学差异(P＜0.01); LEF组、TG组明显低于PNS+TG组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　胸主动脉中各组MCP-1表达（以灰度值表示）:模型组、LEF组、TG组明显低于空白对照组(P＜0.01);PNS+TG组低于空白组(P＜0.05)，模型组明显低于LEF组、TG组、PNS+TG组，呈显著性统计学差异(P＜0.01); LEF组、TG组明显低于PNS+TG组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　心肌中各组VEGF表达（以灰度值表示）:模型组、LEF组、TG组明显低于空白对照组(P＜0.01); PNS+TG组低于空白组(P＜0.05);模型组明显低于LEF组、TG组、PNS+TG组，呈显著性统计学差异(P＜0.01);LEF组、TG组明显低于PNS+TG组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　心肌中各组MCP-1表达（以灰度值表示）:模型组、LEF组、TG组明显低于空白对照组(P＜0.01); PNS+TG组低于空白组(P＜0.05);模型组明显低于LEF组、TG组、PNS+TG组，呈显著性统计学差异(P＜0.01);LEF组、TG组明显低于PNS+TG组，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、胶原诱导关节炎大鼠TNF-α、IL-6、MCP-1、PAI-1、VEGF血清水平明显升高，光镜下主动脉内膜可见脂质沉积、泡沫细胞形成，心肌组织可见炎症细胞浸润，主动脉及心肌MCP-1、VEGF表达增强，证实CIA大鼠存在心血管损伤的相关因素。
　　2、三七总皂苷联合雷公藤多苷明显降低CIA大鼠足爪肿胀度、关节炎指数及血清炎症细胞因子TNF-α、 IL-6水平，且较单用雷公藤多苷或来氟米特效果更优，提示中药有效成分配伍在抗炎方面具有增效作用。
　　3、在防治CIA大鼠心血管损伤方面，三七总皂苷与雷公藤多苷配伍具有显著的增效/协同效应。其心血管保护作用机制包括:降低CIA大鼠血清PAI-1、MCP-1、VEGF及IL-6水平，减少胸主动脉脂质沉积，抑制心肌组织炎性细胞浸润，下调胸主动脉及心肌MCP-1、VEGF表达等。

目录

声明

摘要

前言

材料与方法

1 材料

2 方法

3 统计学处理

结果

1．各组大鼠的一般情况

2 各组大鼠血清TNF-α、IL-6、MCP-1、PAI-1、VEGF水平比较

3 各组大鼠胸主动脉病理变化及VEGF、MCP-1的表达

4 各组大鼠心肌病理学变化及VEGF、MCP-1的表达

附图

附表

讨论

1 RA的心血管损伤的可能机制

2 RA心血管的中医认识

3 中药有效成分配伍对CIA大鼠的治疗作用

4 PNS联合TG对CIA大鼠血清TNF-α、IL-6、PAI-1的影响

5 PNS联合TG对CIA大鼠血清MCP-1、VEGF水平及胸主动脉、心肌MCP-1、VEGF表达的影响

结论

参考文献

综述 类风湿关节炎致动脉粥样硬化的研究进展

致谢

个人简历