DDX25在小鼠精子发生过程中的表达及其与生精细胞凋亡的关系

摘要

目的:目前，全世界有六分之一的夫妇受到不育症的困扰，其中一半以上是男性不育。相当比例的男性不育症患者的睾丸不能产生精子，通常被称为非梗阻性无精子症(NOA)，此类患者的数量在成年男性中占1％左右。在中国，25％的男性不育症患者的长辈中有无精子症患者。多项研究也显示NOA与遗传有关。近年来与男性不育密切相关的基因突变或多态现象相继被发现并日益成为研究热点。因此，对调控精子发生的相关基因的深入研究，不仅有助于阐明特发性不育症的病因，还对男性不育症靶向治疗的发展和男性避孕有重要的理论及应用价值。
　　促性腺激素调节的睾丸RNA解旋酶(DDX25/GRTH)属于DEAD-box家族成员，是目前唯一明确由激素调控的RNA解螺旋酶，由雄激素通过雄激素受体在不同发育阶段调节其转录和翻译水平，其调控途径分别是睾丸间质细胞分泌的雄激素直接作用或睾丸支持细胞中雄激素易感基因介导的间接作用。DDX25在睾丸中特异表达，主要高表达于精母细胞、圆形精子细胞和间质细胞中。DDX25基因敲除的雄性小鼠表现为不育，其形态学表现是精子形成过程被完全阻断在精子发生的第8/9阶段，圆形精子细胞无法变长，造成无精子症，同时还发生了严重的精母细胞凋亡。不同发育阶段及不同生殖细胞表达的差异表明DDX25可能在精子发生过程中的特定阶段发挥不可或缺的作用。也有研究发现，在NOA患者中发现DDX25的单核苷酸多态性，说明DDX25是导致男性不育的重要因素。
　　哺乳动物的精子发生是一个高度精细和复杂的过程，依赖一系列相关基因在特定阶段的顺序表达，在维持生精细胞的增殖、分化和凋亡平衡的过程中伴随多种基因的短暂转录和翻译。目前，针对不育症相关基因的研究已经深入至信号分子水平，主要研究工具是转基因或基因敲除鼠。但是，条件基因的定向敲除不仅容易导致同一睾丸组织中相同细胞的不同表现，而且历时长、耗费巨大、动物易死亡。因此，RNA干扰技术已经成为研究基因功能的重要工具。同时，由于睾丸组织结构与功能的复杂性和特殊性，在整体情况下很难对生殖细胞的功能和与其他细胞间的相互作用进行深入研究。生精细胞体外培养技术的建立使深入阐明精子发生过程和细胞间的关系成为可能。
　　目前为止，应用RNA干扰技术在体内外沉默DDX25基因进行作用的研究尚未见报道。本研究首先检测生后不同日龄即不同发育阶段小鼠睾丸组织中DDX25基因和蛋白表达的情况;其次应用RNA干扰技术在小鼠活体体内抑制DDX25的表达，检测睾丸组织中凋亡相关蛋白的表达变化;再次建立生精细胞的体外培养体系，应用siRNA沉默体外培养生精细胞中DDX25基因，检测沉默DDX25基因对生精细胞凋亡的影响和可能途径，为研究DDX25在精子发生中的功能和可能机制提供新的研究手段和技术方法。
　　方法:
　　1 DDX25在正常小鼠睾丸发育中的表达
　　以出生当天为d0，取出生后d5、d15、d21、d35、d42、d60和d120的C57BL/6J小鼠睾丸组织，4％多聚甲醛固定，制作石蜡切片进行HE染色，观察小鼠睾丸发育的形态结构特点;取60日龄小鼠睾丸组织石蜡切片进行PAS染色，观察精子发生过程中生精上皮的各个时相的形态特点和细胞组成;免疫组化检测DDX25蛋白在精子发生过程中的表达特性和细胞内的定位;免疫印迹检测DDX25在小鼠睾丸组织中的表达，明确DDX25蛋白的表达是否与免疫组织化学结果一致，以避免免疫组织化学产生非特异性着色影响实验结果;RT-qPCR检测DDX25的mRNA在不同日龄小鼠睾丸组织中的表达，明确DDX25基因在小鼠睾丸发育和精子发生过程中的表达特点。
　　2体内抑制DDX25对生精细胞凋亡相关蛋白表达的影响
　　将12周龄雄性C57BL/6J小鼠随机分为7组，(1)空白对照组:只加转染试剂;(2)阴性对照组:转染试剂和control siRNA-A;(3)无关对照组:未加siRNA和转染试剂;(4)阳性对照组:转染试剂和β-actin siRNA;(5)实验组:A组:0.125μg/μl siRNA转染组;B组:0.25μg/μl siRNA转染组;C组:0.5μg/μl siRNA转染组。每组18只小鼠，应用纳米级转染试剂溶解DDX25 siRNA进行睾丸局部注射，于干扰后24、48和72h各取6只小鼠处死取双侧睾丸，一侧的睾丸固定于4％多聚甲醛中做石蜡切片，用于形态学观察;另一侧的睾丸快速放入液氮中冻存用于RNA和蛋白的提取。RT-qPCR检测干扰后各组小鼠睾丸组织中DDX25 mRNA的表达变化，确定干扰效果与有效浓度;HE染色观察干扰后小鼠睾丸组织是否有改变;免疫组织化学、免疫荧光和免疫印迹检测转染前后DDX25蛋白在睾丸组织中的表达情况，确定最佳干扰浓度和作用时间;TUNEL检测睾丸组织中生精细胞的凋亡情况;免疫印迹检测0.25μg/μl siRNA转染组于转染72h后小鼠睾丸组织中Bid, Bad，Bak，Smac， p38MAPK，p-p38MAPK，p53，Bcl-2，Bcl-xL，p-Bad，Erk1/2和p-Erk1/2蛋白表达情况。
　　3体外抑制DDX25对生精细胞凋亡及MAPK信号通路的影响
　　取12周龄雄性C57BL/6J小鼠睾丸组织分别分离纯化睾丸间质细胞和支持细胞-生精细胞混合细胞团，将二者分别接种于Transwell小室和六孔板底进行双室培养，相差显微镜下观察细胞的生长情况;台盼蓝染色法检测生精细胞存活率;应用DDX25 siRNA转染共培养的生精细胞，分组:无关对照组（未加siRNA和转染试剂）;空白对照组（只加转染试剂）;阴性对照组（control siRNA-A和转染试剂）;阳性对照组:(β-actin siRNA和转染试剂);实验组（DDX25 siRNA（12.5nM、25nM、50nM）和转染试剂）。倒置荧光显微镜检测有效干扰浓度;RT-qPCR、免疫组化、免疫荧光与免疫印迹检测评价干扰效能;台盼蓝染色法、流式细胞术、TUNEL法检测转染后生精细胞的凋亡情况;免疫印迹检测干扰前后生精细胞中Erk1/2，p-Erk1/2，p38MAPK和p-p38MAPK蛋白的表达情况。
　　结果:
　　1 DDX25在正常小鼠睾丸发育中的表达
　　(1) DDX25蛋白的阳性表达首先出现于21日龄小鼠睾丸间质细胞的胞质中，呈弱阳性表达;在35日龄小鼠睾丸组织中DDX25蛋白则分别在睾丸间质细胞、精原细胞、精母细胞和圆形精子细胞的胞质中表达，其中间质细胞和精母细胞中的阳性表达较强(p＜0.05);42日龄小鼠睾丸组织中DDX25蛋白表达于间质细胞的胞质，精原细胞、精母细胞和圆形精子细胞的胞核和胞质，其中精母细胞和圆形精子细胞的阳性表达更强(p＜0.05);60日龄和120日龄小鼠睾丸组织中DDX25蛋白的表达与42日龄小鼠睾丸组织中的表达一致，无显著差异(p＜0.05)。(2)对60日龄成年小鼠睾丸生精上皮的生精周期的各个时相进行免疫组织化学检测，结果显示，处于生精周期的12个时相的生精上皮中均有DDX25的阳性表达，其中以Ⅰ、Ⅲ、Ⅴ、Ⅵ、Ⅶ期的阳性表达程度较高。(3)免疫印迹检测结果显示，5日龄和15日龄小鼠睾丸组织总蛋白中无DDX25蛋白条带出现;21日龄睾丸组织总蛋白中分子量61KD处有条带出现;35日龄睾丸组织总蛋白中分子量61KD处有较21日龄灰度明显的单一条带(p＜0.05);42、60和120日龄睾丸组织总蛋白中可见分子量61KD和56KD处两条条带，灰度值没有明显差异(p＜0.05)。(4)RT-qPCR结果显示DDX25基因在不同日龄小鼠组织中均有表达，表达水平从21日龄开始升高，到35日龄表达水平显著上调(p＜0.05)，42日龄后表达上调缓慢，但各日龄小鼠睾丸中DDX25mRNA的表达水平无明显差异(p＜0.05)。
　　2体内抑制DDX25对生精细胞凋亡相关蛋白表达的影响
　　(1)DDX25 siRNA干扰的效能评价:①RT-qPCR检测结果显示，0.125μg/μl siRNA实验组干扰48h和72h后DDX25 mRNA表达低于各对照组，但差异不显著(p＜0.05);干扰24h、48h和72h的0.25μg/μl siRNA实验组和0.5μg/μl siRNA实验组睾丸组织中DDX25 mRNA表达均明显低于各对照组(p＜0.05)，但干扰24h，48h和72h的0.25μg/μl siRNA实验组DDX25 mRNA的表达与0.5μg/μl siRNA实验组无明显差异(p＜0.05)。②形态学观察结果显示:各组小鼠睾丸组织结构基本正常。③免疫组化与免疫印迹结果显示，0.125μg/μl siRNA实验组干扰72h后DDX25表达降低较无关对照组显著(p＜0.05);干扰48h和72h的0.25μg/μl siRNA实验组和0.5μg/μl siRNA实验组DDX25蛋白的阳性表达均显著低于各对照组(p＜0.05);干扰72h的50μg/μl siRNA实验组生精细胞内几乎没有DDX25蛋白的表达。(2)干扰DDX25表达对生精细胞凋亡的影响:TUNEL检测结果显示，干扰72h的0.5μg/μl siRNA实验组生精细胞凋亡率较无关对照组和其他实验组明显增高(p＜0.05)。(3)Western blot检测结果显示，0.5μg/μl siRNA干扰72h后，Bid, Bad,Bak,Smac,p38MAPK,p-p38MAPK和p53的表达在干扰后显著增高(p＜0.05);Bcl-2，Bcl-xL，p-Bad, Erk1/2和p-Erk1/2的表达在干扰后显著降低(p＜0.05)。
　　3体外抑制DDX25对生精细胞凋亡及MAPK信号通路的影响
　　(1)倒置相差显微镜观察，双室培养第5～10天，生精细胞生长状态较稳定，细胞存活率无明显降低(p＜0.05)。(2)分离纯化的生精细胞中DDX25的表达:①免疫组化和免疫荧光结果显示，分离纯化的成年小鼠睾丸的生精细胞中可见DDX25蛋白的阳性表达，主要在精原细胞、精母细胞和圆形精子细胞中表达，其中精母细胞中的表达强度最高(p＜0.05)。②免疫印迹结果显示，分离纯化的成年小鼠睾丸的生精细胞中有DDX25蛋白的阳性表达。(3) siRNA有效转染浓度的筛选:倒置荧光显微镜观察，与12.5nM转染组相比，转染24h后25nM转染组与50nM转染组绿色荧光强度均显著增强(p＜0.05)，但二者强度差别不大(p＜0.05)，转染效率可达95％以上。(4)DDX25 siRNA干扰的效能评价:①RT-qPCR检测结果显示，干扰24h、48h和72h的25nM siRNA实验组DDX25 mRNA表达均明显低于各对照组，(p＜0.05)，其中干扰24h和48h的25nM siRNA实验组DDX25 mRNA的表达较干扰72h组降低更明显(p＜0.05)。②免疫组化、免疫荧光与免疫印迹结果显示，干扰72h的25nM siRNA实验组和50nM siRNA实验组生精细胞中DDX25蛋白的阳性表达均显著低于各对照组(p＜0.05)。(5)干扰DDX25表达对生精细胞凋亡的影响:①台盼蓝染色法检测结果显示，与无关对照组相比，干扰72h的50nM siRNA实验组和25nM siRNA实验组生精细胞存活率明显降低(p＜0.05)，但二者之间无显著差异(p＜0.05)。②流式检测结果显示，参照无关对照组，空白对照组、阴性对照组和阳性对照组的生精细胞凋亡率无明显变化;干扰72h的25nM siRNA实验组和50nM siRNA实验组生精细胞凋亡率率明显增高(p＜0.05)，但二者之间无显著差异(p＜0.05)。(6)Western blot检测结果显示，25nM siRNA实验组干扰72h后生精细胞中Erk1/2和p-Erk1/2的表达较无关对照组显著降低(p＜0.05)，p38MAPK和p-p38MAPK的表达较无关对照组显著升高(p＜0.05)。
　　结论:
　　1 DDX25基因和蛋白在小鼠精子发生过程中呈阶段特异性表达;DDX25主要在成年小鼠的精子发生过程中发挥转录后调控作用，主要作用于精母细胞和圆形精子细胞。
　　2应用纳米材料通过睾丸局部直接注射方法将DDX25 siRNA转染至小鼠体内，能有效抑制DDX25 mRNA的表达，干扰效果良好且无毒性作用。可成为体内研究基因功能的有效方手段。
　　3活体体内DDX25基因沉默后，小鼠睾丸组织中生精细胞的凋亡增多，多种凋亡相关蛋白表达发生改变。
　　4将睾丸间质细胞与支持细胞-生精细胞进行双室培养，生精细胞可以存活达20天以上，可见部分生精细胞尾部出现鞭毛。
　　5应用DDX25 siRNA体外转染生精细胞抑制生精细胞中DDX25的表达使生精细胞凋亡增加; DDX25可能分别通过ERK1/2与p38MAPK途径抑制生精细胞分化和诱导生精细胞凋亡。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 DDX25在发育中的小鼠睾丸内的表达

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分 体内抑制DDX25对生精细胞及其凋亡相关蛋白表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分 体外抑制DDX25对生精细胞凋亡和MAPK信号通路的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 DDX25与精子发生

致谢

个人简历