血管活性肠肽受体在人食管下括约肌的表达规律与功能研究

摘要

人的食管下括约肌(LES)是位于食管与胃的交界部位增厚的肌层，宽约为2-3厘米，由钩状纤维以及套索纤维构成。钩状纤维位于胃小弯侧，形状为半环形，套索纤维位于胃大弯侧呈斜向分布，钩状纤维和套索纤维以及膈肌脚在食管胃的结合部位形成高压带，这几种肌纤维成分组成的高压带使食管下括约肌保持暂时关闭的状态。在静息等一般情况下，人体的食管与胃的结合部位的抗反流机制是因为人食管下括约肌的收缩引起的;当进食或呕吐时，食管下括约肌的暂时性舒张使食物进入胃腔，或者胃内容物反流入食管并经口腔排出。
　　食管下括约肌的正常功能主要是受到中枢神经系统的支配和控制，除此以外体液的以及肌源性的因素也参与其功能的调控，从而保证食管下括约肌发挥正常的生理作用。食管下括约肌运动的神经传导通路包括兴奋性运动传导通路和抑制性运动传导通路，正是由于这些传导通路的激活促进了某些神经递质的释放，从而调节食管下括约肌的舒缩功能。兴奋性运动传导通路的构成包括了节前以及节后胆碱能神经元，激活此兴奋性通路能促进乙酰胆碱等神经递质的释放，使人LES发生收缩作用。而抑制性运动传导通路则包括了NANC神经元，激活该抑制性通路能释放一氧化氮、血管活性肠肽等，使LES产生舒张作用。
　　近些年来对临床上常见的一些与食管运动障碍有关的疾病的研究揭示了这些疾病都与食管下括约肌功能失调有关。为了更好的解释这些疾病的发病原理，从而找到针对它们的最佳的治疗方法，所以理应深入的研究食管下括约肌的调节机制。已有研究显示多种神经递质和受体参与了食管下括约肌舒张、收缩功能的调节，目前已知的研究成果包括一氧化氮、多巴胺受体、胆囊收缩素受体等。
　　血管活性肠肽(vasoactine intrestinal peptide，VIP)作为一种的活性肽类物质，它的生理作用的突出特点之一就是对人和动物多种组织和器官内的血管有显著的扩张的功效。血管活性肠肽与其相应受体结合后发挥生理功能，其介导的生物学活性也多种多样，参与人体心脑血管功能调节、激素分泌、中枢神经系统调节、免疫功能调节及抑制胃肠平滑肌和食管下括约肌张力等作用。根据国际药理学协会的命名规则，把血管活性肠肽受体(VIP-R)划分成如下几种:VPAC1、VPAC2、PAC1受体(即VPAC1R，VPAC2R，PAC1R)。研究表明，哺乳动物的胃肠道内有广泛的VIP受体的分布。
　　本课题使用Western-blot和RT-PCR的方法测定了VPAC1、VPAC2和PAC1受体在人食管下括约肌的表达情况，使用肌条张力测定和电场刺激(EFS)等方法研究了VIP受体各亚型（主要是VPAC2受体亚型）对人食管下括约肌收缩和舒张等功能的影响，探索了VIP受体对人食管下括约肌的收缩和舒张功能产生的影响，对于临床上常见的食管运动障碍性疾病的发病原理和进一步行针对性的治疗具有较重要的意义。
　　第一部分、人食管下括约肌血管活性肠肽受体的表达规律
　　目的:本试验首先使用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定血管活性肠肽(VIP)受体的3种亚型(VPAC1、VPAC2和PAC1受体)在人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维及对照组的mRNA的表达规律，而后使用蛋白印迹法（Western-blot分析）测定VPAC1、VPAC2和PAC1受体在上述部位的受体蛋白的表达规律，从而为以后深入探讨VIP受体的功能调节作用打下一定的基础。
　　方法:从2011年8月到2012年1月之间选择因高位胸中段食管癌在河北医大附属四院行食管切除及消化道重建术的病人30例，在这30例行以上手术方法治疗的病人中包括男性病人以及女性病人各15例，平均为62岁。使用术中切下的食管与胃交界部位的人体组织作为试验用标本，用刀片将上至食管下端下至胃近端之间组织的粘膜和粘膜下层剔除掉并注意保护肌层不被破坏，在食管下端与近端胃交接部位明显增厚的环形肌束就是食管下括约肌(LES)，其中食管下括约肌的钩状纤维处在胃小弯侧的位置，而食管下括约肌的套索纤维处在胃大弯侧的位置，分别制成四种肌组织的标本为下一步试验做准备，分别是食管下括约肌的钩状纤维标本和套索纤维标本，对照组的两种肌组织则采用胃底部环形肌以及食管体部环行肌。被肿瘤组织侵犯的标本弃之不用。提取以上肌条的组织RNA后，使用3种VIP受体亚型(VPAC1R，VPAC2R，PAC1R)的引物并利用逆转录聚合酶链反应的方法进行试验，评估上述食管下括约肌和对照组肌组织中这些受体mRNA的表达情况，用Fotodyne60-2107型Gel-Pro系统测定试验产物的IOD值，肌条中mRNA的含量分别用VPAC1R，VPAC2R，PAC1R的mRNA的IOD值与内参mRNA的IOD值的比来显示。提取肌条组织蛋白，并将蛋白调整至相同浓度。然后应用电泳仪电泳，电泳过程后上述VIP受体的各亚型相应的受体蛋白被分离出来，而后对这些受体蛋白进行转膜，转膜后分别使用VPAC1R，VPAC2R，PAC1R的抗体行孵育的过程。结果由红外荧光扫描成像系统显像，同样肌条中受体蛋白的表达水平分别用VPAC1R，VPAC2R，PAC1R的受体蛋白的IOD值与内参受体蛋白的IOD值的比来显示。
　　结果:试验中经检测提取的RNA纯度较高，符合试验要求。内参β-actin于545bp处亮度均匀，在各个反应中，内参β-actin的PCR扩增结果一致。在人LES的套索纤维和钩状纤维肌条中均可见VPAC2受体mRNA的表达，作为对照组的胃底及食管体部环形肌中也可见VPAC2受体mRNA的表达，而VPAC1和PAC1受体在上述四种肌条中均未见表达。VPAC2受体mRNA的表达在各肌条间无明显差异(F=1.530，P=0.245)。上述四种肌条均可见VPAC2受体蛋白的表达，其分子量为27KD，而VPAC1和PAC1受体蛋白未见表达。VPAC2受体蛋白的表达在上述各肌条间无明显差异(F=1.543，P=0.242)。
　　结论:人食管下括约肌存在VPAC2受体亚型，可能对食管下括约肌的功能调节有一定影响。人食管下括约肌中没有VPAC1和PAC1受体的表达，因此这两种受体可能不会影响食管下括约肌的功能调节。
　　第二部分、血管活性肠肽受体与人食管下括约肌调节机制的研究
　　目的:本实验使用非选择性血管活性肠肽(VIP)受体激动剂(stearyl-VIP)和拮抗剂((N-stearyl norleucine17)VIPhybrid)以及选择性的VPAC2受体激动剂(Ro25-1553)和拮抗剂(PG99-465)研究其对人的食管下括约肌的钩状纤维、套索纤维发挥的效应，初步探索了VIP受体与人食管下括约肌舒张和收缩的调节的关系。
　　方法:试验对象为2012年2月至2012年8月期间因高位胸中段食管癌在河北医大附属四院行食管切除术的病人30例。在这30例行食管切除的病人中男性病人为17例，女性病人为13例，平均66岁。术中由术者采集新鲜手术标本，保证标本残端癌细胞阴性，无肿瘤组织侵犯。以近端胃和食管下端交界区域为实验取材对象，然后将标本的粘膜面朝上放置，在标记部位锐性切开标本，将标本放置于装有Krebs液的容器中，并使用95％氧气(O2)和5％二氧化碳(CO2)对标本通气。按照第一部分叙述的方法找到人食管下括约肌套索纤维以及钩状纤维。顺着肌纤维的方向锐性分离出钩状纤维和套索纤维，制成长约10毫米宽约2毫米的肌条。分别使用丝线系住这些肌条的两端，悬挂于含10毫升Krebs液的浴槽中，温度保持在37℃恒温不变。使用95％氧气(O2)和5％二氧化碳(CO2)对标本通气。肌肉张力换能器与这些肌条的上端相连接，当肌条发生舒缩反应时其肌张力的信号被系统记录下来。牵拉肌条，使肌条保持在200mg的张力，这时的肌条长度被称为初始长度L0。然后注意反复并轻柔地牵拉肌条，每次使其初始长度增加约1/4，直到肌条长度等于初始长度的2倍，此时肌条长度就是肌条的最适初长度。稳定约1小时后，向试验浴槽中加入stearyl-VIP(非选择性VIP受体激动剂)，加药的浓度由10-9 mol/L至10-3mol/L共7个梯度，注意加药浓度为由低到高呈10倍逐步增加。观察加药后肌条的张力所发生的变化，待肌条张力的变化稳定后就进行下一个浓度的加药，每次给药前都要在前一浓度的给药使肌条达到最大反应并且稳定后再给下一浓度药物。给药的间隔时间大约为肌条达到平衡以后10分钟。然后我们可以得出这种逐步加药的反映量效关系的浓度-反应曲线，以及相应的给药浓度和最大效应。在这以后对肌条进行充分地冲洗，待张力稳定后加入(N-stearyl norleucine17)VIPhybrid(非选择性VIP受体拮抗剂)，这时应先加入拮抗剂，半小时后加入激动剂，以此方法观察拮抗剂的拮抗效应，加入拮抗剂的浓度应该和诱导肌条产生最大效应的激动剂浓度是一致的。选择性VPAC2受体激动剂Ro25-1553和拮抗剂PG99-465的加药方法与上述相同。使用肌条收缩或舒张百分比的均数±标准差（(x)±SE）表示上述药物诱发的钩状纤维和套索纤维肌条反应。
　　结果:
　　1.在10-3mol/L浓度时应用非选择性VIP受体激动剂stearyl-VIP能诱导人食管下括约肌钩状纤维和套索纤维均出现舒张反应，两种纤维的舒张反应无统计学差异(P=0.66)。应用非选择性VIP受体拮抗剂(N-stearylnorleucine17)VIPhybrid(10-3 mol/L)不能对stearyl-VIP所产生的套索纤维和钩状纤维的舒张反应产生抑制作用，表现为在10-3mol/L浓度时stearyl-VIP仍然能使上述两种纤维保持原有的舒张作用。
　　2.在给药浓度为10-9 mol/L至10-4mol/L时选择性VPAC2受体激动剂Ro25-1553能够使人食管下括约肌的钩状纤维和套索纤维这两种纤维都出现浓度依赖性的舒张效应。其中前者的最大舒张百分比为（83.6±0.7）％，而后者的最大舒张百分比为（82.6±0.9）％，两种纤维对应达到最大舒张时的浓度均为10-4 mol/L，两种纤维的舒张反应无统计学差异(F=2.22，P=0.14)。使用选择性VPAC2受体拮抗剂PG99-465后可以使钩状纤维和套索纤维的肌条产生舒张的能力明显下降，其中钩状纤维的最大舒张百分比为（53.5±0.8）％，套索纤维的最大舒张百分比为（50.7±0.8）％。使用选择性VPAC2受体拮抗剂前后肌条的舒张反应有明显的统计学差异，钩状纤维和套索纤维分别为(F=157，P＜0.01)和(F=156，P＜0.01)。
　　结论:
　　1.应用非选择性VIP受体激动剂stearyl-VIP能诱导人食管下括约肌出现舒张反应。应用非选择性VIP受体拮抗剂(N-stearyl norleucine17)VIPhybrid不能对stearyl-VIP所产生的这种舒张反应产生抑制作用，这提示VIP可能是通过其VIP受体来实现其对LES的调节作用。
　　2.选择性VPAC2受体激动剂Ro25-1553能够使人食管下括约肌产生浓度依赖性的舒张效应。选择性VPAC2受体拮抗剂PG99-465能够使Ro25-1553诱导食管下括约肌产生舒张的能力明显下降，这说明VPAC2受体可能参与了人食管下括约肌的舒张调节作用。
　　第三部分、电场刺激对人食管下括约肌的效应以及血管活性肠肽受体在其中发挥的作用
　　目的:研究电场刺激(EFS)对人食管下括约肌究竟有何效应，和在使用电场刺激时VPAC2受体拮抗剂对食管下括约肌的两种纤维施加的影响，研究在人食管下括约肌发生舒缩反应的时候VIP受体(主要是VPAC2R)所能发挥的影响。
　　方法:选择2012年8月至2013年2月因胸中段食管癌在河北医大附属四院行食管切除及消化道重建治疗的病人共20例。在这20例行食管切除手术治疗的病人中男性病人为11例，女性病人为9例，平均为60岁。分离并制备套索纤维和钩状纤维这两种肌条的方法与本课题第二部分研究的方法相同。分别使用丝线系住这些肌条的两端，悬挂于含10毫升Krebs液的浴槽中，温度保持在37℃恒温不变。使用95％氧气(O2)和5％二氧化碳(CO2)对标本通气。将肌张力换能器连接至这些肌条的其中一端，肌条另一端则与一种带有铂金电极（行电场刺激用）的固定架相连接。在铂金电极一端对这些肌条进行电场刺激(EFS)，经电场刺激后的肌肉张力的信号被系统记录下来。调节肌条长度至最适初长度的方法与前述相同。将电场刺激设置为如下条件:波形为单脉冲、波宽为5毫秒、电压为50伏、刺激频率从1Hz至512Hz呈整倍数递增(1Hz，2Hz，4Hz，8Hz，16Hz，32Hz，64Hz，128Hz,256Hz，512Hz)，刺激频率由从小至大逐渐增加，电场刺激完成后将其最大效应（Emax）计算出来。EFS完成并待肌条张力恢复平衡后，在试验中分别加入选择性VPAC2受体拮抗剂PG99-465（10-3mol/L）和河豚毒素(TTX)。在给药以后20分钟再对肌条行电场刺激，比较给药前后的电场刺激使人食管下括约肌出现的反应有无明显变化。使用LES肌条的舒张或者收缩的百分率的均数±标准差((x)±SE)来表示本试验中电场刺激引起的这些食管下括约肌肌条的反应。
　　结果:
　　1.电场刺激能够诱发人食管下括约肌的套索纤维和钩状纤维均出现舒张反应，且这种舒张为频率依赖性舒张反应，当电场刺激的频率为64Hz时可以使这两种纤维出现最大的舒张反应，20.1±0.4％为套索纤维的最大舒张百分比，20.4±0.4％为钩状纤维的最大舒张百分比，应用EFS后两种纤维引发的舒张反应无明显差异(F=0.19，P=0.67)。
　　2.对于由电场刺激引起的食管下括约肌的钩状纤维和套索纤维的频率依赖性舒张反应，使用选择性VPAC2受体拮抗剂PG99-465后对这两种纤维均产生了抑制，表现为用药后肌条舒张力下降，用药前后舒张反应的变化有统计学差异。
　　3.对于由电场刺激导致的食管下括约肌的钩状纤维和套索纤维的频率依赖性舒张反应，使用河豚毒素(TTX)后能够对这两种纤维产生显著的抑制，表现为使用TTX后肌条舒张力下降，肌条舒张反应的差异有统计学意义。
　　结论:
　　1.电场刺激能够引起人LES出现频率依赖性舒张反应，当其频率达到64Hz时能引起人LES出现最大程度的舒张反应;
　　2.使用选择性的VPAC2受体拮抗剂PG99-465和河豚毒素(TTX)对EFS作用后的食管下括约肌都能产生显著的抑制作用，用药前后舒张反应有统计学差异。这就说明EFS引起的人食管下括约肌的舒张反应有VPAC2受体的参与，且这种频率依赖性舒张反应是神经来源的。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 人食管下括约肌血管活性肠肽受体的表达规律

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 血管活性肠肽受体与人食管下括约肌调节机制的研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 电场刺激对人食管下括约肌的效应以及血管活性肠肽受体在其中发挥的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述 VIP及其受体对人体生理功能的影响

致谢

个人简历