顺铂联合雷帕霉素、3-MA对胰腺癌A549细胞及其裸鼠原位移植瘤的影响

摘要

目的:
　　1、探讨顺铂分别联合雷帕霉素、3-MA对肺腺癌A549细胞生长的抑制作用及其相关机制;
　　2、探讨顺铂分别联合雷帕霉素、3-MA对裸鼠肺腺癌A549细胞癌原位移植瘤的生长抑制作用和相关机制。
　　方法:
　　一、对肺腺癌A549细胞的处理
　　1、将处于对数生长期的A549细胞用0.25％胰酶消化、收获、计数，调整浓度为1.0×106/ml，每孔200μl接种到96孔板中，过夜贴壁后加入雷帕霉素(RAPA，rapamycin)，使其终浓度分别为0.1 nmol/L，1.0nmol/L，10.0nmol/L，100.0nmol/L，未加药的对照组和加药组各设6个复孔。培养板置37℃、5％ C02孵育箱中继续培养72h后，每孔中加入MTT（浓度5mg/mL）20μL，置37℃、5％ CO2孵箱中继续孵育4h，小心弃上清，每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL，震荡5min，用Bio-Rad酶标仪在测试波长为570nm，滤过波长为655nm处读取吸光度(A)值。细胞增殖抑制率=（对照组平均A值-加药组平均A值）/对照组平均A值×100％抑制率(％)=（A对照-A实验）/（A对照-A空白）100％，同样的方法用于顺铂和3MA。然后用graphpad prism5软件计算出各药物的50％细胞抑制浓度(50％ inhibitory concentration,IC50)，顺铂(DDP) IC50:15μmol/L，雷帕霉素IC50:10nmol/L，3-MAIC50:3μmol/L，并以此作为实验浓度。
　　2、将处于对数生长期的A549细胞用0.25％胰酶消化，将A549细胞分别以每孔1.0×106/ml密度接种于六孔培养板中，待细胞长至孔底面积约70％-80％后分别加入稀释好的药物。本实验分为四组:对照组（无任何药物干预的A549细胞）、顺铂组（在A549细胞中加15μmol/L的DDP）、顺铂+雷帕霉素组（加10nmol/L的RAPA1h后再加15μmol/L的DDP）、顺铂+3-MA组（加3μmol/L的3-MA1h后再加15μmol/L的DDP），分别均培养24h、48h、72h后进行检测。
　　3、细胞划痕实验分别检测用药后24h、48h、72h肺癌A549细胞生长迁移的情况。
　　4、Real time RT-PCR法检测A549细胞经不同药物作用24h、48、72h后mTOR、LC3-Ⅱ及Bax mRNA的表达情况。
　　5、Western blot方法检测A549细胞经不同药物作用48、72h后mTOR、LC3-Ⅱ及Bax的蛋白表达水平。
　　二、对肺腺癌A549细胞癌原位移植瘤的处理
　　1、将处于对数生长期的A549细胞用0.25％胰酶消化，调整成终浓度为1.0×107/ml，用1ml注射器注射到裸鼠右侧腋部皮下，每只0.2ml，共接种24只，饲养约15d（此时裸鼠肿瘤大小达到1cm3左右），将建立好的裸鼠肺腺癌A549细胞原位移植瘤模型随机分为4组，每组6只，即对照组（生理盐水组）、顺铂组(2mg/kg)、顺铂(2mg/kg)+雷帕霉素(1mg/kg)、顺铂(2mg/kg)+3-MA组(2mg/kg)，腹腔注射给药15天，每只裸鼠注射计量为0.2ml/天，对照组和顺铂组每天注射一次，联合用药组为隔天注射一次。用药期间记录裸鼠饮食和精神状态变化，测量裸鼠体重和肿瘤大小，用药结束后处死全部裸鼠，完整剥除瘤体，测量肿瘤大小、计算肿瘤抑制率、HE染色观察肿瘤细胞形态学变化。
　　2、Real time RT-PCR法检测A549细胞裸鼠原位移植瘤模型经药物作用后mTOR、LC3-Ⅱ及Bax mRNA的表达情况。
　　3、Western blot方法及免疫组织化学方法检测A549细胞裸鼠原位移植瘤模型经药物作用后瘤体中mTOR、LC3-Ⅱ及Bax的蛋白表达水平。
　　结果:
　　一、不同药物对肺腺癌A549细胞的作用
　　1、顺铂、雷帕霉素、3-MA单独作用于A549细胞时，均表现为抑制癌细胞生长的作用，且呈时间和浓度依赖性，作用时间越长，药物浓度越大，对细胞的抑制作用越强。
　　2、比较四个分组中药物对A549细胞的抑制作用:24h时间点，顺铂联合雷帕霉素对肺癌A549细胞的抑制作用最强;而48h和72h时间点，顺铂联合3-MA对A549细胞的抑制作用最强。
　　3、不同药物对A549细胞杀伤性的病理学形态观察
　　倒置显微镜下观察A549细胞经不同实验组（对照组、顺铂组、顺铂+雷帕霉素组、顺铂+3-MA组）处理后细胞的形态变化。培养24h时细胞数目略有减少，顺铂组、顺铂+3-MA组、顺铂+雷帕霉素组对A549细胞的杀伤作用依次增强。表现为A549细胞体积变小、变圆并皱缩，折光性差，排列疏松，核浆比变大，贴壁能力减弱，有些细胞胞浆内可见较多颗粒，并出现飘浮的细胞;培养48h后细胞数目继续减少，胞浆内颗粒增多，且可见细胞碎片，贴壁细胞的数量较对照组明显减少。顺铂组、顺铂+雷帕霉素组、顺铂+3-MA组对A549细胞的杀伤作用依次增强。对照组肺癌细胞仍贴壁生长，状况良好。培养72h后细胞数目大量减少，可见明显的细胞碎片，贴壁细胞的数量较对照组显著减少。对照组肺癌细胞生长拥挤，状况欠佳。
　　4、Real time RT-PCR结果显示
　　(1)24h时各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）mTORmRNA的2-△△CT值为1.000±1.000，0.667±0.013，0.418±0.007，0.684±0.024，各用药组与对照组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比，表达量显著降低，有统计学意义（P＜0.05）。24h时各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)LC3-Ⅱ mRNA的2-△△CT值为1.000±1.000，1.489±0.031，1.686±0.069，1.376±0.033，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。24h时各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)Bax mRNA的2-△△CT值为1.000±1.000，1.915±0.041，1.467±0.062，1.324±0.060，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
　　(2)48h时各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）mTORmRNA的2-△△CT值为1.000±1.000，1.796±0.003，0.732±0.007，0.645±0.008，各用药组与对照组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著降低，有统计学意义（P＜0.05）。48h时各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)LC3-Ⅱ mRNA的2-△△CT值为1.000±1.000，1.325±0.007，1.803±0.083，1.253±0.072，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。48h时各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)Bax mRNA的2-△△CT值为1.000±1.000，1.346±0.080，1.133±1.125，1.864±0.104，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义(P＜0.05)。
　　(3)72h时各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）mTORmRNA的2-△△CT值为1.000±1.000，0.749±0.030，0.636±0.034，0.583±0.008，各用药组与对照组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著降低，有统计学意义(P＜0.05)。72h时各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)LC3-ⅡmRNA的2-△△CT值为1.000±1.000，1.428±0.080，1.836±0.056，1.153±0.011，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。72h时各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)Bax mRNA的2-△△CT值为1.000±1.000，1.462±0.029，1.117±0.070，1.935±0.068，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。
　　5、Western blot结果显示
　　(1)48h各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）mTOR的相对表达量分别为1.096±0.036，0.608±0.018，0.454±0.051，0.447±0.011，各用药组与对照组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著降低，有统计学意义(P＜0.05)。48h各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）LC3-Ⅱ的相对表达量分别为0.228±0.018，0.426±0.010，0.556±0.010，0.355±0.009，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义(P＜0.05)。48h各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）Bax的相对表达量分别为0.253±0.006，0.463±0.011，0.392±0.006，0.897±0.022，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。
　　(2)72h时各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)mTOR的相对表达量分别为1.132±0.007，0.573±0.025，0.402±0.009，0.364±0.009，各用药组与对照组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著降低，有统计学意义（P＜0.05）。72h时各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）LC3-Ⅱ的相对表达量分别为0.239±0.008，0.492±0.009，0.571±0.009，0.278±0.009，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。72h时各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)Bax的相对表达量分别为0.248±0.006，0.581±0.007，0.287±0.009，0.916±0.005，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。
　　二、不同药物对肺腺癌A549细胞裸鼠原位移植瘤的作用
　　1、24只裸鼠均成瘤，成瘤率为100％。用药期间各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）裸鼠饮食及精神状态未见明显异常;用药前各组裸鼠体重差异无统计学意义(17.4±2.1g，18.6±2.7g，18.9±1.9g，17.8±2.1g，P＞0.05)，用药后第一天测量各组裸鼠体重，差异无统计学意义(29.1±1.2g，29.4±0.9g，29.7±1.3g，18.9±2.6g，P＞0.05)。药物治疗期间各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）裸鼠肿瘤体积的肿瘤大小分别为1.110±0.035，0.705±0.033，0.623±0.042，0.500，肿瘤的抑制率分别为0％，36.5％，43.9％，55.0％，与对照组相比，差异均有统计学意义（P＜0.05）。
　　2、各组裸鼠原位移植瘤形态学观察结果:显微镜下观察HE染色切片，裸鼠原位移植瘤的瘤组织呈低分化肺腺癌，癌细胞异形性明显，核大深染，细胞形态多样，核染色质呈粗颗粒状。
　　3、Real time RT-PCR结果显示:(1)各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)mTOR mRNA的2-△△CT为1.000±1.000，0.753±0.007，0.635±0.008，0.593±0.012，各用药组与对照组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著降低，有统计学意义(P＜0.05)。(2)各组(对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组)LC3-Ⅱ mRNA的2-△△CT为1.000±1.000，1.316±0.006、1.733±0.007，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义(P＜0.05)。(3)各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）Bax mRNA的2-△△CT为1.000±1.000,1.323±0.008,0.1.178±0.010,1.756±0.024，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义(P＜0.05)。
　　4、Western blot结果显示:(1)各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）mTOR的相对表达量分别为1.290±0.028，0.694±0.017，0.522±0.002，0.485±0.004，各用药组与对照组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著降低，有统计学意义(P＜0.05)。(2)各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）LC3-Ⅱ的相对表达量分别为0.330±0.008，0.581±0.008，0.685±0.008，0.383±0.005，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。(3)各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）Bax的相对表达量分别为0.258±0.006，0.594±0.008，0.296±0.008，0.919±0.020，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义（P＜0.05）;DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。
　　5、免疫组织化学结果:各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）mTOR免疫反应积分中位数为8，6，5，4，各用药组与对照组相比，表达量显著降低，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著降低，差异有统计学意义(P＜0.05)。各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组）LC3-Ⅱ免疫反应积分中位数为2，4，6，3，各用药组与对照组相比，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+RAPA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。各组（对照组，DDP组，DDP+RAPA组，DDP+3-MA组） Bax的免疫反应反应积分中位数为2，5，3，7，各用药组与对照组相比，表达量显著上升，差异均有统计学意义(P＜0.05);DDP+3-MA组与DDP组相比，表达量显著上升，有统计学意义（P＜0.05）。
　　结论:
　　一、不同药物对肺腺癌A549细胞的作用
　　1、顺铂联合雷帕霉素、顺铂联合3-MA均可以对A549细胞生长产生抑制作用，且该作用大于单独使用顺铂对癌细胞造成的抑制作用。
　　2、顺铂联合雷帕霉素与顺铂联合3-MA相比，24h时前者的对肺癌A549细胞的抑制作用大于后者，而48h和72h时结果相反。
　　3、顺铂+雷帕霉素组在24h时间点LC3-Ⅱ表达显著高于其它组，而在48h和72h顺铂+3-MA组Bax表达显著升高。提示早期顺铂+雷帕霉素组可能因自噬占据细胞死亡的主导地位，而后期（顺铂+3-MA组）可能因抑制自噬反而激活凋亡，使癌细胞大量死亡。
　　二、不同药物对肺腺癌A549细胞裸鼠原位移植瘤的作用
　　顺铂+雷帕霉素组、顺铂+3-MA组均可以抑制肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤的生长，且抑制作用均大于单独使用顺铂时对肿瘤的抑制作用。提示雷帕霉素、3-MA均可以提高顺铂的化疗敏感性。

目录

声明

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材料与方法

结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 PI3K／AKT／mTOR通路与肿瘤自噬与凋亡的研究进展

致谢

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