五味子乙素预防BaP致HTR8-SV neo细胞凋亡损伤的研究

摘要

多环芳烃是常见的空气污染物，苯并(a)芘(BaP)是多环芳烃中最有代表性的污染物，主要来自于煤炭燃烧、烟草烟雾、烹调油烟和汽车尾气，容易在土壤、水体和作物中残留蓄积[1]。有研究发现，苯并(a)芘与不良妊娠结局的发生有关，如流产、低出生体重及畸形等，还和生育能力下降、不孕不育有关[2-5]，其可能的作用机制包括参与氧化损伤、DNA损伤、细胞凋亡、细胞色素P450酶的代谢及抗雌激素效应等[6-11]。
　　五味子（北五味子）属于木兰科植物，具有滋肾、止泻、敛肺、宁心、涩精、安神等功效，其主要成分五味子乙素不仅具有抗氧化和抗凋亡功能[12-15]，还具有体外抑菌[16]，抗肿瘤[17-18]，抗DNA损伤[19]等作用。但五味子乙素在空气污染物致胚胎损伤的预防作用方面的研究尚未见报道。本实验通过构建苯并芘(BaP)损伤人绒毛膜外滋养层细HTR8-SVneo模型，探讨五味子乙素预防BaP致HTR8-SVneo细胞凋亡损伤的作用。
　　目的:研究五味子乙素通过抗调亡途径预防苯并(a)芘(bap)对人绒毛膜外滋养层细胞的损伤作用，为将其开发为环境污染物生殖毒性的保护剂提供理论依据和实验基础。
　　方法:
　　1、构建细胞模型: MTS法分别检测五味子乙素、 BaP对人绒毛膜外滋养层细胞的生长曲线影响，研究发现1～20μmol/L BaP作用24h均可使细胞生存率下降，且细胞生存率随着BaP作用浓度的加大而下降，根据细胞生存率和染毒强度，选择细胞抑制率在30％左右、染毒强度20μmol/L、作用24小时构建的BaP损伤模型。1～2μmol/L的五味子乙素，作用24小时后对细胞有保护作用，而10～200μmol/L对细胞有损伤作用，据此实验分组:空白组、BaP（20μmol/L）染毒组、五味子乙素(0.5、1、2μmol/L)+Bap（20μmol/L）染毒组。
　　2、采用Hoechst33342荧光双染技术、流式细胞技术分别观察细胞的形态学变化和细胞的凋亡率，JC-1荧光探针法检测细胞的线粒体膜电位变化。
　　3、ELISA法分别检测细胞内细胞色素C、Bax、Bcl-2的蛋白浓度，Western-blot法分别检测细胞的Caspase3，Caspase9蛋白量的表达。
　　结果:
　　1、五味子乙素对BaP损伤的保护作用
　　MTS法发现，空白对照组OD值为1.568±0.012，BaP染毒组为1.187±0.015，0.5μmol/L五味子乙素为1.483±0.022，1μmol/L五味子乙素为1.489±0.048，2μmol/L五味子乙素为1.531±0.240，与BaP染毒组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　2、五味子乙素对BaP损伤模型中细胞凋亡情况的影响
　　实验结果发现五味子乙素可以降低BaP对人绒毛膜外滋养细胞的凋亡损伤。Hoechst33342染色实验结果观察到BaP损伤模型中出现了细胞凋亡的形态学改变，用流式细胞仪检测每组细胞的凋亡率，发现不同浓度的五味子乙素预处理24h可降低BaP损伤模型细胞凋亡率，空白对照组凋亡率为0.031±0.001，BaP染毒组为0.123±0.04，0.5μmol/L五味子乙素为0.064±0.008，1μmol/L五味子乙素为0.052±0.020，2μmol/L五味子乙素为0.036±0.014，与BaP染毒组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　3、五味子乙素对BaP损伤模型中线粒体膜电位变化的影响
　　结果表明不同浓度的五味子乙素预处理24h后可降低BaP损伤模型细胞的线粒体膜电位变化，空白对照组红/绿荧光强度为10.20±2.37，BaP染毒组为3.35±0.85，0.5μmol/L五味子乙素为6.99±0.53，1μmol/L五味子乙素为7.15±1.22，2μmol/L五味子乙素为8.73±1.05，与BaP染毒组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　4、五味子乙素对BaP损伤模型中细胞色素C，bax，bcl-2蛋白浓度的影响
　　ELISA法检测发现0.5、1、2μmol/L的五味子乙素预处理24h后可使BaP损伤模型细胞内细胞色素C，bax浓度降低，bcl-2浓度升高，与BaP染毒组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　5、五味子乙素对BaP损伤模型中caspase3，caspase9表达的影响
　　Western-blot法检测0.5、1、2μmol/L的五味子乙素预处理24h后可降低BaP损伤模型细胞caspase3，caspase9的表达，与BaP染毒组相比，差异有统计学意义(P＜0.05)。
　　结论:
　　本研究从线粒体凋亡的信号通路层面探讨了五味子乙素对Bap所致HTR8-SVneo细胞凋亡损伤可能的预防作用及部分机制，发现五味子乙素可以通过降低细胞内bax蛋白的浓度、升高bcl-2蛋白的浓度，使线粒体膜电位的丢失减少，阻碍细胞色素C从线粒体释放到胞浆，进而抑制下游凋亡信号Caspase-9、Caspase-3表达，从而达到抗凋亡作用。
　　因此，我们认为五味子乙素可以预防苯并芘造成的人绒毛膜外滋养层细胞的凋亡损伤。

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材料与方法

结果

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附表

讨论

结论

参考文献

综述 五味子乙素的药理作用

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