维生素K2对高磷诱导的大鼠血管平滑肌细胞钙化的影响和机制

摘要

目的:慢性肾脏病(Chronic Kidney disease，CKD)患者死亡的首要病因是心血管疾病(Cardiovascular Disease，CVD)，血管钙化是导致CKD患者CVD发病率和死亡率增加的关键环节，CKD患者的血管钙化主要发生在血管中膜。血管中膜的主要成分是血管平滑肌细胞(Vascular SmoothMuscle Cells，VSMCs)，研究发现，维生素K2可以抑制血管中膜钙化，但其具体机制尚不明确。为了探讨维生素K2对血管中膜钙化的影响及作用机制，本实验以高磷诱导的VSMCs钙化为模型，观察了维生素K2对其核心结合因子α1（Core factor of alpha1，Cbfα1）mRNA及蛋白和骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein2，BMP-2)、SMAD1、SMAD7、Axl(Anexelekto)、B-细胞淋巴瘤/白血病-2(B-cell lymphoma/leukemia-2，Bcl-2)基因mRNA的表达变化以及细胞凋亡的影响。
　　方法:
　　1、运用胸主动脉组织块贴壁法原代培养获取VSMCs，进行形态学及免疫细胞鉴定。
　　2、实验分组:将VSMCs随机分为正常对照组、高磷组干预组、维生素K2干预组（10μmol/L）、维生素K2干预组（25μmol/L）及维生素K2干预组（50μmol/L），阴性对照组采用低糖DMEM含10％胎牛血清的正常培养基培养，高磷组在正常培养基的基础上加入10 mmol/L的β-甘油磷酸制成高磷培养基培养，维生素K2干预组在上述高磷培养基的基础上加入维生素K2，使维生素K2的终浓度分别为10μmol/L、25μmol/L和50μnol/L。
　　3、钙化检测:VSMCs的钙化通过茜素红染色来检测，并用比色法检测其钙含量。
　　4、运用RT-PCR方法观察了不同浓度维生素K2对VSMCs中核心结合因子α1（Core factor of alpha1，Cbfα1）mRNA及蛋白，骨形态发生蛋白2(Bone morphogenetic protein2,BMP-2)、SMAD1、SMAD7、Axl(Anexelekto)、B-细胞淋巴瘤/白血病-2(B-celllymphoma/leukemia-2，Bcl-2)基因mRNA表达水平的影响。
　　5、运用Western-blot方法观察了不同浓度维生素K2对VSMCs中Cbfα1蛋白表达水平的影响。
　　6、运用流式细胞仪检测细胞凋亡率:先以0.25％胰酶消化收集的各组细胞，再用磷酸盐缓冲液(PBS)清洗2次，将细胞重悬于70％乙醇中固定24h后，加入适量PI染液混匀，室温15 min后上机。
　　7、统计学方法:实验所取得的数据均用均数±标准差（(x)±S）表示，采用SPSS13.0软件进行统计分析，组间的均数比较采用单因素方差分析(ANOVA)，两两比较用SNK(Student-Newman-Keuls)检验，结果以P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果:
　　1、VSMCs原代培养:大鼠VSMCs的获取采用胸主动脉组织块贴壁培养法，一般情况下大约3-4d后即可见少许细胞爬出，形态为长梭形，排列较分散，约6-7d后细胞数目逐渐增多，铺满大部分瓶底。当80％-90％的瓶底面积铺满细胞后，便可进行传代培养，传代后的细胞最初近似为圆形，贴壁后其逐渐变为梭形或星型，有突起，细胞胞浆丰富，核大呈椭圆形，典型的呈现为“峰—谷”样交互重叠生长。通过免疫细胞化学法检测α-平滑肌肌动蛋白抗体(α-SMA actin)，其为平滑肌细胞特异性的抗体，出现棕黄色的免疫反应产物在细胞胞浆强表达，即为阳性结果。几乎所有细胞均在细胞胞浆强表达。
　　2、维生素K2对高磷诱导的大鼠VSMCs钙化的影响:培养至第14天时茜素红染色结果显示，高磷组的橘红色矿化结节明显多于正常对照组;与高磷组相比，维生素K2干预组的橘红色矿化结节减少，且随维生素K2浓度的增高，橘红色矿化结节越来越少。钙含量测定结果与茜素红染色结果基本一致。
　　3、维生素K2对高磷诱导的大鼠VSMCs的BMP通路的影响:RT-PCR法观察结果显示，与正常对照组相比，高磷组的BMP-2和SMAD1mRNA表达明显增高(P＜0.05)，而维生素K2干预组的BMP-2和SMAD1mRNA表达随浓度增高而逐渐降低(P＜0.05)。高磷组的SMAD7mRNA表达明显降低(P＜0.05)，而维生素K2干预组的SMAD7mRNA表达随浓度增高而逐渐升高(P＜0.05)。
　　4、维生素K2对高磷诱导的大鼠VSMCs凋亡的影响:PI染色结合流式细胞仪检测结果显示，与正常对照组相比，高磷干预组细胞凋亡率显著增加(P＜0.05);与高磷干预组相比，维生素K2各剂量干预组细胞凋亡率均显著降低(P＜0.05)。RT-PCR法研究结果显示，与正常对照组相比，高磷组Axl mRNA表达明显减弱(P＜0.05)，维生素K2干预组的AxlmRNA表达增加，且随维生素K2浓度的增高，Axl mRNA表达逐渐增高，以50μmol/L维生素K2组达最高（见图3）。而Bcl-2的表达各组间差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论:
　　1、本课题采用胸主动脉组织块贴壁法成功地培养了大鼠VSMCs，为VSMCs原代培养搭建了一个平台。
　　2、维生素K2可以抑制高磷诱导的VSMCs的血管钙化。
　　3、维生素K2抑制VSMCs的血管钙化的机制，一方面与维生素K2抑制BMP信号通路相关基因的表达，进而抑制了血管平滑肌细胞成骨成软骨样表型转化有关;另一方面与维生素K2的抗凋亡作用有关。

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结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述 维生素K在血管钙化中作用的研究进展

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