慢性丙型肝炎干扰素联合利巴韦林治疗优化方案及Th17细胞免疫调控机制的研究

摘要

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus，HCV)感染是严重危害人类健康的疾病之一。据世界卫生组织统计，全球约有1.85亿HCV感染者，每年新发丙型肝炎病例约3.5万例，HCV相关死亡35万例，占所有传染病死因的第5位。我国报告的HCV感染率逐年上升，2013年报告病例数超过22万人。急性HCV感染后55％～85％慢性化，进一步进展为肝硬化，甚或并发肝细胞癌。因此，及时、有效的治疗是阻止该病进展，改善患者生活质量的重要措施。
　　近年来，欧美国家已成功研发多种直接抗病毒药物(directing antiviralagents，DAAs)，并经临床应用获得满意效果。但由于DAAs价格昂贵，长期效果有待随访研究，我国目前仍以干扰素(interferon，IFN)联合利巴韦林(ribavirin，RBV)为常规治疗方案。研究证实，完成足量、全程治疗人群持续病毒学应答率(sustained virological response，SVR)达78％～93.5％，但由于上述药物不良反应较多，部分患者难以耐受，因此，优化及个体化的治疗方案可提高依从性，提高SVR率，改善预后。
　　宿主固有免疫和适应性免疫状态与HCV感染的预后及抗病毒治疗应答密切相关，尤其HCV特异细胞免疫低下，可能为HCV感染慢性化的重要因素。辅助性T细胞17(T-helper17，Th17)，以分泌白细胞介素17（Interleukin-17，IL-17）作为其主要的效应因子，在多种免疫介导的炎症性疾病中发挥重要作用。IL-23作为Th17细胞的上游因子，其调节与Th17细胞的增殖与激活有关。有文献报道，IL-23参与慢性肝病的免疫及炎症反应的发生发展，但关于慢性HCV感染过程中，IL-23调节对Th17细胞及其相关抗病毒分子表达的影响尚不十分清楚。因此，通过HCV感染患者血浆IL-23水平检测、外周血Th17细胞功能研究以及IL-23/IL-17轴调节与抗病毒治疗应答关系的研究，将有助于慢性HCV感染抗病毒治疗策略的优化及预后的判断。
　　第一部分慢性丙型肝炎优化治疗方案的研究
　　目的:筛选适于我国不同慢性HCV感染人群的抗病毒治疗方案，以改善患者依从性、提高治愈率。
　　方法:采用前瞻、开放性临床研究，选择2010年1月至2015年3月在河北医科大学第三医院、邢台市人民医院、邯郸市传染病医院、白求恩国际和平医院、沧州市传染病医院、河北医科大学第一医院、石家庄市第五医院、围场县医院住院慢性HCV感染者652例。根据患者年龄(＜65岁或≥65岁)、体重（＜60kg或≥60kg）、合并疾病状态（是否有肝硬化、糖尿病、心脏疾病、甲状腺疾病等）及患者经济承受能力选择不同治疗方案:标准剂量组分别采用IFNα-2b500MIU，皮下注射，隔日一次或聚乙二醇干扰素(pegylated interferon，PegIFN)α-2a180μg、PegIFNα-2b80μg，皮下注射，每周一次，均联合应用RBV1200mg/d;小剂量组为IFNα-2b100MIU～300MIU，皮下注射，隔日一次或PegIFNα-2a67.5～135μg、PegIFNα-2b50μg，皮下注射，每周一次，均联合应用RBV900mg/d。根据病毒学应答出现时间制定总疗程，即HCV RNA低于检测下限，继续治疗44周，随访24周。并在治疗前及治疗期间监测血常规、血清生化、糖耐量试验、HCV RNA载量、血沉、风湿三项、肝病自身抗体、甲状腺功能、T淋巴细胞亚群、肝纤维化四项及甲胎蛋白，并行腹部超声检查。对比分析不同治疗方案病毒学应答率，包括快速病毒学应答(rapidvirological respons，RVR)、完全早期病毒学应答(complete early virologicalresponse，cEVR)和持续病毒学应答(sustained virological response，SVR);相关因素，包括宿主因素、病毒因素（病毒载量、基因型）、治疗应答时间;不良反应发生情况，包括流感样症候群、一过性骨髓抑制、甲状腺功能异常、精神异常、皮疹等。
　　结果:
　　1患者一般情况652例患者中，482例(73.93％)为输血及血制品感染，手术/外伤感染73例(11.20％)，其他97例(14.87％)。364例患者HCV基因型检测显示，1b型260例(71.43％)，2a型76例(20.88％)。240例采用IFNα-2b治疗，其中小剂量109例，男50例，女59例，平均年龄49.56±12.45岁，平均体质量指数(Body mass index，BMI)23.57±3.32kg/m2;标准剂量组131例，男53例，女78例，平均年龄45.92±10.23岁，平均BMI为24.14±3.22kg/m2。PegIFNα-2a治疗组357例，其中小剂量组92例，男33例，女59例，平均年龄为50.83±13.41岁，平均BMI为23.72±3.46kg/m2;标准剂量组265例，男120例，女145例，平均年龄为46.73±11.36岁，平均BMI为23.69±3.04kg/m2。PegIFNα-2b治疗组55例，其中小剂量组29例，男16例，女13例，平均年龄为51.19±13.70岁，平均BMI为22.83±2.78kg/m2;标准剂量组26例:男12例，女14例，平均年龄48.20±13.44岁，平均BMI为24.32±2.35kg/m2，各标准剂量与小剂量组相比，在性别、年龄、体重指数、治疗前血清ALT水平、HCV RNA载量以及HCV基因型构成等方面差异均无统计学意义（P＞0.05）。
　　2治疗应答情况 IFNα-2b标准剂量组、小剂量组RVR、cEVR、SVR率分别为64.12％、90.08％、80.68％和41.28％、68.81％、71.43％，标准剂量组RVR及cEVR率均明显高于小剂量组（P均＜0.001），而SVR率两组相比无统计学差异(P＞0.05)。PegIFNα-2a标准剂量组和小剂量组RVR、cEVR、SVR率分别为74.34％、94.34％、88.84％和63.04％、83.70％、83.10％，标准剂量组RVR及cEVR率显著高于小剂量组（分别为P＜0.05，P＜0.01）。PegIFNα-2b标准剂量组、小剂量组RVR、cEVR、SVR率分别为73.08％、100％、100％和34.48％、79.31％、64.71％，标准剂量组RVR、cEVR及SVR率均明显高于小剂量组(分别为P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05)。不同类型干扰素组比较，IFNα-2b治疗组RVR、cEVR、SVR率分别为53.75％、80.42％和76.82％，PegIFNα-2a治疗组分别为71.43％、91.60％和87.58％，PegIFNα-2b治疗组分别为52.73％、89.09％和80.00％。三种类型干扰素相比，RVR、cEVR及SVR率均有明显差异（分别为P＜0.001，P＜0.001，P＜0.05）。两两比较，PegIFNα-2a治疗组RVR率明显高于IFNα-2b治疗组及PegIFNα-2b治疗组（分别为P＜0.001，P＜0.01），同时，PegIFNα-2a治疗组cEVR及SVR率均明显高于IFNα-2b治疗组（分别为P＜0.001，P＜0.05）。发生代偿期肝硬化患者(n=38)和非肝硬化患者(n=614) RVR、cEVR、SVR率分别为34.21％、57.89％、66.67％和65.15％、89.09％、84.87％，非肝硬化患者RVR、cEVR、SVR率均显著高于发生代偿期肝硬化患者(分别为P＜0.001，P＜0.001，P＜0.05)。HCV基因1型感染者(n=282)和非HCV基因1型感染者(n=82) RVR、cEVR、SVR率分别为56.38％、84.75％、81.40％和79.27％、92.68％、85.94％，非HCV基因1型感染者RVR率显著高于HCV基因1型感染者(P＜0.001)。具体到不同的干扰素治疗组，IFNα-2b治疗组基因1型感染患者(n=94)和非HCV基因1型感染患者(n=33)获得RVR、cEVR及SVR率分别为43.62％、72.34％、70.91％和72.73％、93.94％、86.36％，非HCV基因1型患者RVR及cEVR率均明显高于基因1型感染患者（分别为P＜0.01，P＜0.05）。PegIFNα-2a治疗组基因1型感染患者(n=163)和非HCV基因1型感染患者(n=39)获得RVR、cEVR及SVR率分别为65.64％、92.02％、86.99％和87.18％、92.31％、86.49％，非HCV基因1型患者RVR率明显高于基因1型患者(P＜0.01)。而PegIFNα-2b治疗组基因1型感染患者(n=25)和非HCV基因1型感染患者(n=10)获得RVR、cEVR、SVR率分别为44.00％、84.00％、64.29％和70.00％、90.00％、80.00％，基因1型患者与非基因1型患者相比RVR、cEVR及SVR率均无统计学差异(P＞0.05)。
　　3不良反应发生情况 IFNα-2b、PegIFNα-2a和PegIFNα-2b不良反应发生率分别为5.42％、9.24％和3.64％;代偿期肝硬化和非肝硬化患者分别为2.63％和6.65％;基因1型感染患者和非基因1型感染患者分别为5.03％和7.41％;小剂量组和标准剂量组不良反应发生率分别为IFNα-2b7.34％和3.82％, PegIFNα-2a12.12％和5.66％, PegIFNα-2b3.45％和3.85％,差异均无统计学意义（P＞0.05）。
　　结论:根据患者年龄、体重、合并疾病及家庭经济承受力等情况优化抗HCV治疗方案，并依据治疗早期病毒学应答情况调整疗程，可显著改善耐受性、依从性，提高SVR率，改善预后。
　　第二部分 Th17细胞在慢性HCV感染中的作用及其与IFN/pegIFN+RBV治疗应答的关系
　　目的:探明慢性HCV感染者Th17细胞亚群及其表达免疫相关因子水平变化、与抗病毒治疗应答的相关性，为抗HCV治疗效果提供新型预测标志。
　　方法:选择慢性HCV感染者66例，包括IFNα-2b/RBV13例、PegIFNα-2a/RBV53例，疗程为48～72周。另选性别、年龄匹配的20例健康体检者作为对照组。采用流式细胞术检测健康对照及慢性HCV感染者在抗病毒治疗前、治疗12、24、48周外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)中表达IL-17A、IFN-γ、IL-21细胞亚群的比率，分析其与病毒学应答的关系。
　　结果:慢性HCV感染者表达IL-17A+PBMCs（中位数为4.16％）、表达IFN-γ+PBMCs(8.17％)比率均显著高于健康对照组(分别为1.18％和1.38％)，而表达IL-21+ PBMCs(2.15％)比率显著低于健康对照组(4.51％)，P均＜0.001。IFNα-2b/RBV或PegIFNα-2a/RBV治疗后，54.5％(39/66)获得RVR，89.4％(59/66)获得cEVR。治疗12周时，表达IL-17A+PBMCs(1.00％)和表达IFN-γ+PBMCs(3.26％)比率较基线水平显著降低（分别为P＜0.001，P＜0.01）。治疗24和48周时，表达IL-17A+PBMCs比率与12周相比无明显统计学差异（分别为1.57％和0.90％，P＞0.05）;而表达IFN-γ+PBMCs比率在治疗24周时(1.83％)较12周轻微降低(P＞0.05)，在48周时(1.51％)与12周相比明显降低(P＜0.001)。表达IL-21+PBMCs比率在治疗12周时(4.01％)较基线水平显著升高(P＜0.05);在治疗24周时(1.91％)较12周明显下降(P＜0.001)，恢复至基线水平;而治疗48周时(1.44％)与基线水平相比明显降低(P＜0.05)。同时，获得RVR的患者基线表达IL-21+PBMCs比率明显高于未获得者（分别为2.18％和1.88％，P＜0.05）。
　　结论:干扰素联合利巴韦林治疗可通过下调表达IL-17A+及IFN-γ+PBMCs比率和上调表达IL-21+PBMCs比率发挥协同抗病毒作用，提高病毒学应答率。
　　第三部分 IL-23调控对Th17细胞及抗病毒分子表达的作用
　　目的:明确慢性HCV感染患者血浆IL-23水平的变化，并进一步观察IL-23调控对Th17细胞活性的影响，为慢性HCV感染靶向性免疫治疗策略的研发奠定基础。
　　方法:选择慢性HCV感染者55例，年龄、性别匹配的健康对照20例，采用酶联免疫吸附试验(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)检测血浆IL-23水平。其中留取24例慢性HCV感染者和15例健康对照外周血，依据密度梯度离心法分离PBMCs，分为3组进行体外培养:空白组:不予任何干预;IL-23激动剂组:加入人IL-23重组蛋白;IL-23拮抗剂组:加入抗人IL-23 P19功能等级纯化蛋白。上述细胞在37℃、5％CO2的条件下共培养48h，分离细胞培养上清液，ELISA法检测空白组IL-23表达水平;各组PBMCs均采用实时荧光定量PCR检测IL-17A、IL-21、IL-22、IFN-γ、两面神激酶(janus kinase1，JAK1)、信号传导及转录激活因子1(signal transducer and activator of transcription1,STAT1)、STAT3、干扰素调节因子9（Interferon regulatory factor9，IRF9）、粘病毒抗性蛋白A（myxovirus resistance protein A，MxA）、细胞因子信号传导抑制蛋白3(suppressor of cytokine3，SOCS3)、表达于T淋巴细胞上的T盒(T-boxexpressed in T cells，T-bet)、GATA结合蛋白3(GATA binding protein3，GATA3)、叉头状螺旋转录因子3（forkhead box P3，FoxP3）mRNA表达水平。
　　结果:慢性HCV感染者血浆（中位数为107.17 pg/ml）及PBMCs培养上清IL-23水平（23.18 pg/ml）均显著高于健康对照组（分别为69.03pg/ml和6.06 pg/ml），P值分别为＜0.05和＜0.001;治疗后获得RVR的患者基线血浆IL-23水平(103.65 pg/ml)与未获得者（121.07 pg/ml）相比无统计学差异，P＞0.05。HCV患者空白组、IL-23激动剂组和IL-23拮抗剂组PBMCs表达IL-17A（分别为P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）、IL-22（分别为P＜0.001，P＜0.001，P＜0.01）、IFN-γ(分别为P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05)和GATA3（分别为P＜0.01，P＜0.05，P＜0.05）mRNA水平均显著高于健康对照各组。IL-21(P均＜0.05)和STAT3(P均＜0.001)mRNA增高见于IL-23激动剂和拮抗剂组;负反馈抑制因子SOCS3 mRNA增高见于空白组和IL-23激动剂组（分别为P＜0.01，P＜0.05）;转录因子FoxP3 mRNA则于空白组和IL-23拮抗剂组显著增高(分别为P＜0.05，P＜0.001);通路因子STAT1、抗病毒蛋白MxA mRNA增高仅见于空白组（分别为P＜0.01，P＜0.001）;而转录因子T-bet和通路因子JAK1、IRF9 mRNA水平三组间无统计学差异（P＞0.05）。健康对照各处理组间比较显示，PBMCs表达MxA和SOCS3 mRNA水平在IL-23激动剂组明显增高（P均＜0.01）。JAK1、STAT3、IRF9、IL-22和IFN-γ mRNA表达水平在IL-23拮抗剂组显著下降（分别为P＜0.05，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.01，P＜0.05）。STAT1mRNA表达水平在IL-23激动剂组显著增高(P＜0.01)，而在IL-23拮抗剂组明显降低(P＜0.01)。FoxP3 mRNA表达水平在IL-23拮抗剂组较IL-23激动剂组显著增高(P＜0.01)。而IL-17A、IL-21、T-bet和GATA3三组间无明显统计学差异(P＞0.05)。HCV感染者组间比较显示，PBMCs表达IL-21和IFN-γ mRNA水平在IL-23激动剂组显著增高（分别为P＜0.01，P＜0.05）。IL-22、STAT1和IRF9 mRNA表达水平在IL-23拮抗剂组明显降低（分别为P＜0.01，P＜0.001，P＜0.01）。STAT3、MxA、SOCS3 mRNA表达水平在IL-23激动剂组明显升高（分别为P＜0.001，P＜0.01，P＜0.01），在IL-23拮抗剂组明显下降（分别为P＜0.05，P＜0.05，P＜0.01）。而FoxP3 mRNA表达水平在IL-23激动剂组较空白组轻微降低(P＞0.05)，相反，在IL-23拮抗剂组明显增高(P＜0.01)。IL-17A、JAK1、GATA3和T-bet mRNA表达水平三组间无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:HCV感染患者血浆及PBMCs表达IL-23水平显著增高;IL-23调节可增强表达Th17的PBMCs活性，上调IL-17A、IL-21、IL-22、IFN-γ等免疫因子及抗病毒蛋白MxA表达，抑制转录因子FoxP3及GATA3表达，进而促进抗HCV免疫反应，提示IL-23及其下游Th17细胞可能为慢性HCV感染治疗的重要免疫靶点。

目录

声明

摘要

英文缩写

引言

第一部分 慢性丙型肝炎优化治疗方案的研究

前言

材料与方法

结果

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分 Th17细胞在慢性HCV感染中的作用及其与IFN／pegIFN+RBV治疗应答的关系

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分 lL-23调控对Th17细胞及抗病毒分子表达的作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一 Th17细胞在慢性HCV感染中作用及免疫调节机制的研究进展

综述二 干扰素相关抗病毒蛋白的作用机制及其抗丙型肝炎病毒感染的研究进展

致谢

个人简历