胃癌及转移淋巴结中Vav1表达及与肿瘤耐药关系的研究

摘要

目的：据统计，世界范围内胃癌位居恶性肿瘤第4位，每年新发胃癌约90余万人，死亡约70万人。我国属于胃癌的高发地区，每年新发胃癌患者人数约占世界范围内的42％。胃癌患者早期症状及体征不明显，发现时多数已处于进展期，甚至晚期，手术治疗辅以化疗已经成为最常见的治疗方式。合理化疗可以提高胃癌患者治疗疗效，并延长生存时间。肿瘤的多药耐药性（Multiple drug resistance, MDR）是影响患者治疗疗效的关键因素。MDR包括原发性耐药和继发性耐药，其作用机制极度复杂，由多因素、多步骤参与，并且转移过程中肿瘤耐药性会发生异质性改变。通过对多药耐药蛋白1（Multidrug resistance MDR1）/P-糖蛋白（P-glycoprotein P-gp）、多药耐药相关蛋白1（Multidrug resistance protein1 MRP1）、胸苷酸合成酶（Thymidylate synthase TS）、谷胱甘肽转移酶（Glutathione-S-transferase GST-π）等多个耐药蛋白以及与之相关的分子机制的深入研究是逆转化疗失败的关键。因此积极寻找新的胃癌耐药相关因子有重要意义。Vav1是一种原癌基因。它具有鸟苷酸交换因子（GEF）活性，属于 Db1家族中的一员，已有研究发现 Vav1在多种恶性肿瘤中有表达，并在肿瘤局部进展与远处转移过程中发挥着非常重要的作用，是恶性肿瘤患者预后不良的标志之一。研究发现[1] Vav1能够显著上调抗凋亡基因 Bcl-2的转录活性，从而使细胞免于凋亡，Vav1的GEF活性是上调Bcl-2所必须的。而 Bcl-2可通过协调 P-gp增加肿瘤细胞对抗肿瘤药物的耐药[2]，由此可推测 Vav1与肿瘤的 MDR可能存在较密切关系。
　　本研究以42例进展期胃癌原发病灶组织及转移淋巴结组织为研究对象，采用实时荧光定量 PCR法（realtime fluorescence quantitative polymerase chain reaction, qPCR）检测Vav1的mRNA在两种不同胃癌组织中的表达差异及关系。应用免疫组织化学染色技术检测 Vav1、MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π在胃癌及转移淋巴结中的表达，并对Vav1与四种耐药蛋白在胃癌及转移淋巴结中的表达的相关性进行研究。采用四氮唑蓝法（MTT）检测不同机制化疗药（氟尿嘧啶5-FU、足叶乙苷 VP-16、紫杉醇 PTX、顺铂 CDDP、氨甲喋呤 MTX）对胃癌原发灶和相应转移淋巴结细胞的抑制情况，并进行对比分析，探讨 Vav1与胃癌MDR的关系及意义。
　　方法：
　　收集42例进展期患者胃癌组织及转移淋巴结新鲜组织标本及相应患者的中性甲醛所固定胃癌及转移淋巴结组织标本，采用实时荧光定量PCR技术，在mRNA水平检测 Vav1在胃癌组织及转移淋巴结中的表达，另采用免疫组织化学染色法在蛋白水平检测 Vav1及相关耐药蛋白（MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π）在胃癌及转移淋巴结中的表达。通过做相关分析，明确 Vav1与肿瘤耐药相关蛋白的关系及意义。采用四氮唑蓝法（MTT）检测化疗药（氟尿嘧啶5-FU、足叶乙苷 VP-16、紫杉醇 PTX、顺铂 CDDP、氨甲喋呤 MTX）对5组细胞体外化疗药敏性。所得数据应用 SPSS21.0软件进行分析，计量资料的比较采用 t检验。计数资料应用χ2检验。相关性的分析应用 spearman相关分析。P＜0.05具有统计学意义。
　　结果:
　　1 Vav1蛋白与mRNA在胃癌及转移淋巴结组织中的表达强度差异以及相关性：
　　Vav1蛋白在转移淋巴结组织中的表达明显高于胃癌组织（χ2=5.927，P=0.015），在转移淋巴结组织与胃癌原发灶组织中 Vav1蛋白表达具有明显相关性（r=0.359，P=0.019）。Vav1 mRNA在转移淋巴结组织中的表达高于胃癌组织（0.379±0.233 vs0.123±0.081，t=7.818， P=0.000），且二者之间有明显相关性（r=0.418，P=0.006）。
　　2 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在胃癌及转移淋巴结组织中的表达以及相关关系：
　　MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在转移淋巴结组织中的表达明显高于胃癌组织（χ2=5.974；χ2=7.683；χ2=4.421；χ2=4.266， P=0.015, P=0.006；P=0.035；P=0.039）。在转移淋巴结组织与胃癌原发灶组织间 MDR1/P-gp、MRP1、GST-π蛋白表达具有明显的相关性（ r=0.380；r=0.336；r=0.311， P=0.013， P=0.030；P=0.045）；在转移淋巴结组织与胃癌原发灶组织中 TS蛋白无明显相关关系（ r=0.28， P=0.072）。
　　3在胃癌及转移淋巴结组织蛋白水平 Vav1与 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π间的相关关系。
　　胃癌组织中 Vav1与 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π的表达，在蛋白水平呈正相关关系（ r=0.378；r=0.440；r=0.437；r=0.348， P=0.014；P=0.004；P=0.004；P=0.024）。
　　转移淋巴结组织中 Vav1与 MDR1/P-gp、MRP1在蛋白水平的表达呈正相关关系（ r=0.365；r=0.335， P=0.017；P=0.030）；而 Vav1与TS、GST-π在胃癌转移淋巴结组织中蛋白表达水平无明显相关关系（r=0.229；r=0.023， P=0.136；P=0.883）。
　　45-FU、VP-16、PTX、CDDP、MTX在胃癌原发灶与淋巴结转移灶之间体外化疗药敏性比较
　　胃癌原发灶与淋巴结转移灶中的化疗药物抑制率比较， VP-16对转移淋巴结瘤细胞抑制率明显较原发灶高（ t=-2.28， P=0.025）；而5-FU、PTX、CDDP、MTX，对胃癌原发灶及淋巴结转移灶的瘤细胞抑制率之间的差异无统计学意义（ t=-1.23；t=-0.94；t=1.06；t=0.69, P=0.223；P=0.352；P=0.291；P=0.490）。
　　5 Vav1、MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在胃癌原发灶与淋巴结转移灶表达与相应组织中瘤细胞体外化疗药敏感性关系
　　胃癌原发灶中 Vav1弱表达组对5-FU、PTX的瘤细胞抑制率明显高于强表达组（t=2.34,t=2.14, P=0.024；P=0.038）。P-gp强表达组对5-FU的瘤细胞抑制率明显低于弱表达组，（t=2.71, P=0.010）。TS强表达组对5-FU、CDDP的瘤细胞抑制率明显低于低表达组（ t=4.40； t=2.19, P=0.000；P=0.019）。MRP1强表达组对5-FU、PTX、CDDP的瘤细胞抑制率明显低于弱表达组（t=2.12；t=2.09；t=4.26, P=0.040；P=0.043；P=0.000）。GST-π强表达组对5-FU、PTX、CDDP的瘤细胞抑制率明显低于弱表达组（ t=2.17；t=2.48；t=2.13, P=0.036；P=0.017；P=0.040）。
　　淋巴结转移灶中 Vav1弱表达组对5-FU、CDDP的瘤细胞抑制率明显高于强表达组（t=2.10；t=2.37, P=0.042；P=0.023）。P-gp强表达组对5-FU、PTX、CDDP的瘤细胞抑制率明显低于弱表达组(t=2.34；t=2.05；t=2.11， P=0.025；P=0.047；P=0.041)。TS强表达组对5-FU、PTX的瘤细胞抑制率明显低于弱表达组（ t=2.13；t=2.27， P=0.039；P=0.029）。MRP1强表达组对5-FU的瘤细胞抑制率明显低于弱表达组（t=3.85，P=0.000）。GST-π强表达组对 CDDP的瘤细胞抑制率低于低表达组（t=3.16，P=0.003）。
　　结论:
　　1 Vav1蛋白质和mRNA在胃癌转移淋巴结组织中的表达水平明显高于胃癌组织，表明 Vav1在胃癌组织和转移淋巴结病灶之间存在异质性，提示 Vav1可能参与了胃癌的侵袭转移过程，是胃癌进展的一个重要因素。
　　2 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在胃癌组织中的表达水平明显低于转移淋巴结病灶，说明耐药蛋白在胃癌及转移淋巴结中存在异质性表达，提示转移病灶耐药性更强以及有更强的进展趋势。
　　3胃癌组织的Vav1表达水平与MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π呈正相关性，转移淋巴结中 Vav1表达水平与 MDR1/P-gp、MRP1呈正相关关系，提示胃癌组织中 Vav1参与的侵袭、转移在疾病进展过程可能与胃癌耐药分子网络存在着交叉，或通过某种调控机制共同促进胃癌的进展。
　　4通过体外药敏实验结果显示胃癌转移淋巴结细胞对 VP-16敏感性明显高于原发灶，而对5-FU、PTX、CDDP、MTX的药敏性不同，提示胃癌转移过程中耐药性发生了异质性改变，以原发灶的耐药结果并不能全面、准确地推断淋巴结转移灶的药敏性。
　　5在胃癌及转移淋巴结细胞中 MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π的表达对5-FU、VP-16、PTX、CDDP、MTX敏感性不同，提示胃癌及转移淋巴结中化疗药敏性存在异质性改变。只以任何一种 MDR相关因子
　　反映胃癌原发灶与转移灶的药敏性均是不全面的。在胃癌原发灶中 Vav1表达对5-FU敏感性降低，而在转移淋巴结中对 CDDP的敏感性降低，提示 Vav1可能参与了 MDR过程，并在某种程度上可预测 MDR，但在胃癌转移过程中耐药性发生了改变。对 VP-16、CDDP、MTX敏感性无显著差异，提示Vav1只是胃癌MDR调节网络中其中的一个因素。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料和方法

1一般资料及标本处理:

2主要试剂和仪器

3实验方法

4统计学分析

结果

1胃癌原发病灶与转移淋巴结组织中Vav1 mRNA与蛋白的表达强度比较与关系

2 胃癌原发病灶与转移淋巴结组织中 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白的表达

3 Vav1与MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在胃癌原发病灶、转移淋巴结组织中双变量相关分析

4 5-FU、VP-16、PTX、CDDP、MTX在胃癌原发灶与淋巴结转移灶之间细胞体外化疗药敏性比较

5 Vav1、MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在胃癌原发灶中的表达与化疗药敏的关系（Table 7）

6 Vav1、MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π蛋白在淋巴结转移灶中的表达与化疗药敏的关系（Table 8）

附图

附表

讨论

1 Vav1蛋白和mRNA在胃癌及转移淋巴结中的表达

2 MDR1/P-gp、TS、MRP1、GST-π在胃癌及转移淋巴结中的表达

3胃癌与转移淋巴结中Vav1的表达与四种耐药蛋白的关系

4 5-FU、VP-16、PTX、CDDP、MTX在胃癌与转移淋巴结细胞之间体外化疗药敏性

5 胃癌原发灶与转移淋巴结细胞中 Vav1、MDR1/P-gp、MRP1、TS、GST-π表达分别对5-FU、VP-16、PTX、CDDP、MTX的耐药关系

结论

参考文献

综述: Vav1在恶性肿瘤中的表达及其与肿瘤耐药的关系

致谢

个人简历