胃癌及转移淋巴结中Pokemon表达与肿瘤耐药关系的研究

摘要

目的：作为国内最常见消化系统恶性肿瘤中的一种，胃癌早期发现的不易导致临床病例往往处于进展期，伴有局部或远处转移，影响预后。化疗被纳入挽救胃癌病人生命有效疗法，可是多药耐药(multidrug resistance,MDR)致使部分病例失去疗效，为造成较高死亡率众因素之一。MDR为肿瘤细胞对某一特定药物及其他分子布局、起效途径不同的化疗药均表现耐药。它包括原发性和继发性耐药，前者指在化疗开始即对多种药物不敏感；后者指在开始化疗时有良好效果，接受一段时间的用药后对所用药物出现耐药性。MDR产生的机制复杂，是多基因、多途径综合调控的结果。Pokemon(POK erythroid myeloid ontogenic factor), POK红系髓性致癌因子，属于转录抑制因子 POK家族，在胚胎生长、分化及癌形成历程起重要影响。研究表明 Pokemon既能调控肿瘤细胞生长，还能通过多种机制对某些癌基因和抑癌基因进行调控，从而被称为肿瘤总开关。目前虽有资料表明 Pokemon与多种恶性肿瘤发生、发展息息相关，但对它是否参与肿瘤多药耐药并不肯定。本课题以胃癌及相应转移淋巴结为研究对象，采用实时荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real-time polymerase chain reaction,qPCR)以及免疫组织化学链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结(streptavidin-perosidase,SP)法检测 Pokemon及四种肿瘤耐药相关因子 mRNA及蛋白表达情况，并行噻唑蓝[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide,MTT]药敏性实验，探索Pokemon与肿瘤耐药相关蛋白以及Pokemon与化疗药敏性的关系，为临床治疗提供新的理论基础。
　　方法：取40例进展期胃癌病人原发灶及对应转移淋巴结新鲜标本，采用实时荧光定量聚合酶链式反应和免疫组织化学 SP法检验 Pokemon在原发灶及转移淋巴结的表达；选取免疫组化SP法检验胃癌原发灶与转移淋巴结中 P-糖蛋白(p-glycoprotein,P-gp)、多药耐药相关蛋白-1(multidrug resistance associated protein-1,MRP-1)、谷胱甘肽-S-转移酶-π(glutathione-S-transferase-π,GST-π)、胸苷酸合酶(thymidylatesynthase,TS)的表达；采用 MTT法检测5-氟尿嘧啶(5-Fluorouracil,5-Fu)、长春新碱(Vincristine,VCR)、紫杉醇(Paclitaxel,PTX)、奥沙利铂(Oxaliplatin,OXA)影响胃癌原发灶与转移淋巴结细胞体外抑制情况；分析 Pokemon和肿瘤耐药相关因子以及 Pokemon和化疗药敏性之间联系。全部数据使用SPSS19.0软件解析，P<0.05具统计学意义。
　　结果：
　　1、胃癌及转移淋巴结中Pokemon的表达
　　免疫组织化学结果显示，Pokemon蛋白在胃癌原发灶和转移淋巴结高表达率分别是65％、70%，此差别无显著性(P>0.05)。相关性分析表明， Pokemon蛋白于胃癌原发灶与淋巴结两部位间表达无明显相关性(r=-0.128, P>0.05)。荧光定量 PCR结果显示胃癌原发灶和转移淋巴结里Pokemon mRNA相对表达量分别是0.196±0.375、0.098±0.071，经Wilcoxon符号秩检验，差异无统计学意义(Z=-0.282，P=0.778)。经相关分析，Pokemon mRNA表达于胃癌原发灶和转移淋巴结两部位间没有明显相关关系(r=0.077,P=0.637)。
　　2、胃癌及转移淋巴结中P-gp、MRP-1、GST-π、TS蛋白的表达
　　免疫组化结果表明，P-gp、MRP-1和 TS蛋白在转移淋巴结表达显著高于胃癌原发灶(82.5%vs57.5%,75%vs55%,72.5%vs52.5%,均 P<0.05)；转移淋巴结、原发灶 GST-π蛋白表达强度没有显著区别(72.5%vs65%,P>0.05)。相关分析表明 P-gp、MRP-1于胃癌原发灶、转移淋巴结两部位间表达分别具有正相关关系(r=0.332,r=0.427,均P<0.05)。
　　3、胃癌及转移淋巴结中Pokemon与P-gp、MRP-1、GST-π、TS的相关性
　　经相关性检测，在胃癌组织，Pokemon分别同P-gp、MRP-1、TS的表达呈现正相关性(r=0.399,r=0.428,r=0.508,均 P<0.05)；在转移淋巴结， Pokemon与 P-gp、MRP-1之间的表达均具有正相关性(r=0.325,r=0.326,均P<0.05)。
　　4、胃癌及转移淋巴结细胞对5-Fu、VCR、PTX、OXA化疗药物敏感性比较
　　VCR、OXA作用转移淋巴结细胞的抑制率显著小于原发灶(t=2.056, t=2.481,均 P<0.05),5-Fu、PTX作用于这两种细胞时抑制率无显著差异(P>0.05)。
　　5、胃癌及转移淋巴结细胞中Pokemon表达与化疗药敏性关系
　　在原发灶中，VCR、PTX作用 Pokemon高表达组肿瘤细胞时抑制率显著小于低表达组(t=2.417,t=3.281,均 P<0.05)；而转移淋巴结，5-Fu、VCR、OXA作用 Pokemon高表达组肿瘤细胞时抑制率显著小于低表达组(t=2.071,t=2.220,t=2.558,均P<0.05)。
　　结论：
　　1、Pokemon于胃癌原发灶与转移淋巴结都存在较高阳性表达率，启示 Pokemon可能参与了胃癌侵袭转移，可以作为基因治疗的靶点；Pokemon于胃癌原发灶与转移淋巴结的表达间没有相关关系，提示Pokemon在胃癌原发灶与转移淋巴结发挥的作用不同，无明显规律性。
　　2、P-gp、MRP-1、GST-π、TS于胃癌癌组织与转移淋巴结都存在较高的高表达率，提示与胃癌原发性耐药形成存在某种联系；P-gp、MRP-1和 TS蛋白在转移淋巴结的表达比原发灶高，表明胃癌原发灶和转移淋巴结存在耐药性差别，转移淋巴结可能更具耐药性。
　　3、在胃癌原发灶和转移淋巴结，Pokemon分别与 P-gp、MRP-1表达间存在正相关关系，提示 Pokemon通过某种机制可以调控 P-gp、MRP-1表达，参与了胃癌原发性多药耐药；Pokemon与 TS的表达在胃癌原发灶具有正相关性而在淋巴结无相关性，提示 Pokemon可能参与了对 TS的调控，但出现了异质性改变。
　　4、Pokemon表达仅影响部分化疗药物的敏感程度，提示胃癌多药耐药是多因素网络化作用结果。

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中文摘要

英文摘要

前言

材料与方法

1材料

2实验方法

3统计学方法

结果

1胃癌及转移淋巴结中Pokemon的表达

2胃癌及转移淋巴结中P-gp、MRP-1、GST-π、TS蛋白的表达

3胃癌及转移淋巴结中Pokemon与P-gp、MRP-1、GST-π、TS的关系

4 胃癌及转移淋巴结细胞对 5-Fu、VCR、PTX、OXA化疗药物敏感性比较

5胃癌及转移淋巴结细胞中Pokemon表达与化疗药敏性关系

附图

附表

讨论

1胃癌及转移淋巴结中Pokemon的表达

2胃癌及转移淋巴结中P-gp、MRP-1、GST-π、TS的表达

3 胃癌及转移淋巴结中 Pokemon表达与 P-gp、MRP-1、GST-π、TS的关系

4 胃癌与转移淋巴结细胞对 5-Fu、VCR、PTX、OXA化疗药物敏感性

5 胃癌及转移淋巴结细胞Pokemon表达与5-Fu、VCR、PTX、OXA抑制率的关系

结论

参考文献

综述:Pokemon与恶性肿瘤的关系

致谢

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