促肾上腺皮质激素释放因子通过对GSK3β的磷酸化促进U87MG细胞的凋亡

摘要

背景：胶质瘤是中枢神经系统中最常见的肿瘤，呈浸润性生长，易侵犯重要的神经结构，预后差，复发率及死亡率高。虽然外科手术和放化疗治疗效果都有了极大的提高，但是还远未达到理想的效果。能否通过生物治疗（靶向治疗）延长患者生存期，这给我们提供了一个全新的思路。
　　研究表明，提高细胞内cAMP水平并激活cAMP依赖的信号转倒途径能够促进中枢及外周各种神经组织的存活。在CRF作用于小脑颗粒细胞的研究中发现CRF-CRFR-cAMP-PKA激活，最终导致GSK-3β的磷酸化在神经保护作用中发挥重要作用[1]。GSK3β的生物学功能较复杂，在肿瘤细胞侵袭与转移及凋亡、癌细胞基因转录、加速细胞周期过程中起到调控作用。GSK3β在不同遗传背景的细胞中发挥不同的作用，所以必须明确特定细胞中GSK3β激活与失活所发挥的作用才能进一步加以利用。前期实验研究发现 CRF能促进胶质瘤 U87MG凋亡，且凋亡相关蛋白capase-3的表达与细胞凋亡趋势一致，进一步研究发现 CRF作用于 U87细胞后细胞内cAMP及PKA水平明显升高。CRF作用于两种细胞后上游信号分子的表达趋势一致，但是结果却完全相反，所以有必要进一步研究CRF作用下U87MG内GSK3β的活性状态及对细胞凋亡所起的作用。
　　目的：研究CRF作用于人脑胶质瘤U87MG细胞后pGSK3β在细胞浆和细胞核的表达情况，探讨pGSK3β在CRF促进U87MG细胞凋亡中所起作用。
　　方法：
　　1.免疫荧光显微镜检测正常U87细胞和CRF作用后的细胞内pGSK3β是否有表达。
　　2.培养U87细胞，用不同浓度CRF（10-7，10-8，10-9 mol/L）进行干预，干预时间分为12h，24h，36h，每个浓度和时间点都设置相应的对照组。然后应用胞浆/胞核蛋白提取试剂盒分开提取胞浆和胞核蛋白，用western blot检测细胞浆及细胞核pGSK3β的表达情况。
　　结果：
　　1.免疫荧光显微镜显示：对照组和实验组都有pGSK-3β的表达。
　　2.Western blot检测细胞浆与细胞核pGSK-3β的结果显示：CRF10-7 mol/L组:12h，24h实验组细胞浆和细胞核pGSK-3β的表达量与对照组无明显差别（胞浆 Z12h=-1.091， P=0.1375， Z24h=-0.218， P=0.4135，胞核Z12h=-0.655，P=0.2565，Z24h=-0.655，P=0.2565）。36h实验组细胞浆和细胞核pGSK-3β的表达量明显高于对照组（胞浆Z36h=-1.964，P=0.025，胞核Z36h=-1.964，P=0.025）。CRF10-8 mol/L组:12h，24h实验组细胞浆和细胞核 pGSK-3β的表达量与对照组无明显差别（胞浆 Z12h=-1.107， P=0.134，Z24h=-1.528，P=0.0635，胞核Z12h=-0.655，P=0.2565，Z24h=-1.091， P=0.1375）。36h实验组细胞浆和细胞核pGSK-3β的表达量明显高于对照组（胞浆Z36h=-1.964，P=0.025，胞核Z36h=-1.964，P=0.025）。CRF10-9 mol/L组:12h，24h，36h实验组细胞浆和细胞核pGSK-3β的表达量与对照组无明显差别（胞浆Z12h=-0.655，P=0.2565，Z24h=-0.218，P=0.4135，Z36h=-0.218， P=0.4135，胞核Z12h=-0.218，P=0.2135，Z24h=-1.091，P=0.1375，Z36h=-1.091， P=0.1375）。
　　3.36h实验组胞浆和胞核pGSK-3β/36h对照组胞浆和胞核pGSK-3β的统计结果显示：CRF10-7 mol/L, CRF10-8 mol/L, CRF10-9 mol/L三组之间存在明显差别（胞浆 Chi-square实验组/对照组=7.200， P=0.027，胞核Chi-square实验组/对照组=7.200，P=0.027）。
　　结论：
　　1.免疫荧光显微镜显示：U87MG细胞内存在pGSK-3β的表达。
　　2.Western blot检测细胞浆与细胞核pGSK-3β的结果显示：CRF能够促进GSK3β的磷酸化，且呈浓度依赖性，浓度越高作用越强。

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前言

材料与方法

1 实验材料

2 实验方法

3 实验前细胞的分组及处理

4 细胞胞浆和胞核蛋白的提取

5 免疫荧光细胞标本的制备

6 细胞蛋白的定量

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述: 促肾上腺皮质激素释放因子（CRF）、糖原合成酶激酶-3（GSK3）、环磷酸腺苷反应元件结合蛋白（CREB）间相互关系的研究进展

致谢

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