大鼠脑缺血再灌注损伤后DWI和AQP4蛋白表达相关性研究

摘要

目的：脑水肿是脑缺血后主要的病理表现，研究表明水通道蛋白4（aquaporin-4,AQP4）在脑梗死后脑水肿的形成和发展中起着重要作用，目前对脑缺血再灌注损伤后不同时期磁共振弥散加权成像（diffusion weighted imaging,DWI）和AQP4蛋白表达之间的相关性研究较少。因此本研究运用DWI动态评价大鼠脑缺血再灌注损伤后脑损伤区AQP4蛋白表达和表观扩散系数（apparent diffusion coefficient,ADC）之间的相关性以及AQP4表达与缺血性脑水肿之间的关系。
　　方法：
　　1、80只SD雄性大鼠，体重270-300g，随机分成8组，分别为脑缺血再灌注1h、3h、6h、12h、1d、3d、7d组和假手术组，采用线栓法制作大鼠右侧大脑中动脉缺血再灌注（middle cerebral artery occlusion/reperfusion,MCAO/R）模型。
　　2、采用Zea Longa评分法对假手术组和缺血再灌注后不同时间点大鼠进行神经功能评分。
　　3、使用Philips Achieva3.0T MR扫描仪对假手术组和缺血再灌注后不同时间点大鼠脑部行冠状位扫描，扫描序列包括T1WI、T2WI、DWI，在工作站上重建ADC图，测量基底节层面梗死灶DWI信号强度（signal intensity,SI）和ADC值，计算相对ADC值（rADC）和相对DWI-SI（rDWI-SI）值。
　　4、采用2，3，5-氯化三苯基四氮唑（2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride,TTC）染色测量大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时间点梗死体积的变化。
　　5、采用HE染色观察假手术组和脑缺血再灌注大鼠不同时间点（12h、1d、3d）的组织形态学变化。
　　6、采用免疫组化染色测定假手术组和脑缺血再灌注大鼠不同时间点（12h、1d、3d）脑组织中AQP4蛋白表达，测量平均光密度值（mean optical density,MOD）值评价染色程度。
　　结果：
　　1、假手术组动物麻醉苏醒后未见神经功能缺损，神经功能评分均为0。脑缺血再灌注1h大鼠出现神经损伤，左侧肢体无力，肌张力降低，左侧转圈，不能饮食。3h-1d时症状加重，1d时部分向对侧倾倒，3-7d时症状改善，恢复饮食。1h神经功能评分升高，3h-1d之间神经功能评分无明显统计学差异，3-7d神经功能评分减低，7d时神经功能评分较1d明显降低（P<0.05）；
　　2、假手术组DWI及ADC图均未见异常信号。MCAO/R后1h DWI上纹状体及周围部分皮层区域出现高信号，相应部位ADC值降低。1h-1d DWI高信号面积随时间推移逐渐增大，信号强度逐渐增高，3-7d时开始降低。rADC值随时间先降低后升高，6h达到最低，12h开始回升，1d时rADC值较12h再次降低（P<0.05）。3d时开始回升，7d时与假手术组无明显差异（P>0.05）；1h-1d rDWI持续升高，1d达最高峰，3-7d开始下降，7d时仍明显高于假手术组；
　　3、HE染色结果显示假手术组海马及皮层区结构未见明显异常，细胞结构完整，细胞核染成深蓝色，胞浆丰富，染色质均一。MCAO/R后12h缺血侧海马区及皮层区出现缺血性损害，可见部分浓染细胞和胞浆空泡形成，核固缩，但细胞排列尚好；1d时缺血侧神经元缺血性损伤加重，细胞排列紊乱，细胞间隙增宽，出现大量胞浆空泡化，核固缩显著；3d时缺血侧海马区空泡化有所减轻；
　　4、假手术组TTC染色未见白染区域，均染成红色。模型组1h可见右侧纹状体及周围少许皮层染成苍白色，为梗死区域；1h-1d白染区域逐渐扩大，包括右侧基底节区及额颞叶皮层，3-7d范围较1d时缩小。1h-1d时梗死体积随时间推移逐渐增加，6h-1d之间增加最快，1-3d时达到峰值，7d时梗死体积减小，但7d仍高于6h（P<0.05）。脑缺血再灌注1h-1d缺血侧脑水肿体积随时间持续增加，1d达到高峰，3d时开始下降，7d明显减低；
　　5、假手术组海马区及皮层区AQP4免疫组化染色较浅淡。MCAO/R后12h缺血侧海马区及皮层均可见AQP4阳性着色细胞，12h-3d AQP4 MOD随时间延长逐渐增高，3d时达到高峰，三组AQP4表达水平均明显高于假手术组（P<0.05）；
　　6、模型组各时间点神经功能评分与相应时间点基底节区梗死灶rDWI-SI呈显著性正相关（r=0.503，P=0.000）；相应时间点脑梗死体积、水肿体积与rDWI-SI均呈显著性正相关（r=0.542，P=0.001；r=0.740，P=0.000）；
　　7、12h、1d、3d组大鼠脑水肿体积与相应时间点缺血侧皮层区AQP4表达水平的MOD值呈正相关（r=0.642，P<0.05），与海马区AQP4表达水平的MOD值呈正相关（r=0.605，P<0.05)；三组大鼠基底节区梗死灶rADC值与缺血侧皮层区、海马区AQP4表达水平呈正相关（r=0.542，P=0.037；r=0.655，P=0.008）。
　　结论：
　　1、磁共振扩散加权成像及ADC值的变化对评价脑缺血再灌注损伤具有高度的敏感性和特异性，对脑缺血再灌注损伤后梗死灶的动态改变具有直观的价值。
　　2、大鼠脑缺血再灌注后脑水肿体积、rADC值与AQP4的表达水平存在时间上的相关性；12h-1d时脑水肿体积及AQP4表达水平明显增加，1d到3d时水肿体积轻度下降，而AQP4表达水平仍继续升高，这提示AQP4在急性期（12h-1d）时可能参与了缺血再灌注后脑水肿的形成，而亚急性期（1d-3d）可能与防止脑水肿进一步加重、清除脑内过多的水分有关。
　　3、结合DWI检查，对脑缺血后AQP4表达部位、作用以及调节机制进行更深入系统的研究可能为临床治疗缺血性脑水肿提供新的诊断思路和治疗方法。

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前言

材料与方法

1 材料

2 实验动物模型的建立和分组

3 模型组大鼠神经功能评分及纳入标准

4 MRI扫描及扫描参数

5 TTC染色

6 组织固定及取材

7 石蜡切片HE染色

8 免疫组织化学法检测AQP4表达

9 统计学处理

结果

1 缺血再灌注后各时间点神经功能评分变化

2 缺血再灌注后鼠脑rDWI-SI及rADC值随时间的变化

3 缺血再灌注后各时间点梗死体积、水肿体积的变化

4 HE染色结果

5 缺血再灌注后12h、1d、3d脑内APQ4蛋白表达的变化

6 神经功能评分、脑梗死体积、水肿体积和rDWI-SI之间的相关性分析

7 三组大鼠脑水肿体积、rADC值与AQP4相关性分析

附图

附表

讨论

1 脑缺血再灌注模型的制备

2 磁共振弥散加权成像（DWI）和缺血性脑梗死

3 AQP4蛋白与脑梗死的关系及其临床意义

结论

参考文献

综述: 水通道蛋白在脑内分布、功能的研究进展

致谢

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