基于细胞色素P450代谢酶的间尼索地平代谢转化及药物-药物相互作用(DDI)研究

摘要

间尼索地平(m-nisoldipine)[化学名称：1,4-二氢-2,6-二甲基-4-(3-硝基苯基)-3,5-吡啶二羧酸甲酯异丁酯]是由河北医科大学药学院首次合成，具有自主知识产权的一类新型二氢吡啶类药物，存在一个手性中心，可拆分为两个光学对映体（R,S-m-nisoldipine）。药理学实验表明，该化合物具有抑制血管平滑肌收缩和扩张血管的药理活性，在心血管系统和血流动力学方面表现出显著的疗效。前期药代动力学实验表明，仅有少量原型药物经粪便和胆汁排泄，且尿中未检出，提示间尼索地平主要以代谢物的形式排出体外，原型药物排泄较少，此外目前的研究主要针对的是间尼索地平的消旋体，而对其对映体较少涉及。因此有必要对间尼索地平及其手性对映体的体内外代谢情况进行系统的研究。
　　肝脏是体内Ⅰ相和Ⅱ相代谢的最主要器官，是药物体内处置的重要场所。由于肝脏中的细胞色素CYP450酶是参与药物代谢和生物活化的主要酶类，因此药物与 CYP450酶相互作用的研究，以及药物对于 CYP450酶的影响的研究就变得很有必要，同时该类研究也为药物联合治疗的作用机制研究提供了理论依据。由于大部分药物经由CYP450代谢，当药物联合应用时发生的药物相互作用是由于一种药物通过诱导或抑制酶特定的亚型，从而影响了另一种药物的代谢特征，导致药物的相互作用。因此对于一种新化学实体而言，有必要对此方面进行研究，而间尼索地平在此方面的相关研究尚属空白。
　　由于HPLC/MS的高灵敏度和高选择性，该方法被广泛应用于药物在体内的定量和定性分析研究。鉴于药物代谢本身的复杂性及其潜在的药物-药物相互作用，HPLC/MS方法已成为主要的药代动力学和CYP450酶的研究手段。
　　本研究基于液相色谱-质谱联用技术和多种体内外模型，系统研究间尼索地平及其光学对映体的体内外代谢轮廓及其代谢表型；采用HPLC-MS联用技术及实时定量聚合酶链式反应技术，借助本研究建立的特异性体外CYP450酶探针检测方法，基于人肝癌细胞系HepG2和人肝微粒体代谢模型，系统分析了基于CYP450酶的间尼索地平手性对映体潜在的药物-药物相互作用（DDI）；采用HPLC-MS联用技术，以大鼠作为研究对象，通过本研究建立的体内CYP450酶探针检测方法，系统分析了在不同剂量下，长期给予间尼索地平对肝药酶的影响。
　　第一部分基于HPLC-Q-TRAP/MS技术的间尼索地平对映体的代谢表型研究
　　目的：本研究基于高效液相色谱-四级杆-线性离子阱质谱串联技术（HPLC-Q-TRAP/MS），采用CYP450酶亚型选择性抑制剂，研究主要参与间尼索地平对映体在大鼠肝微粒体中代谢转化的CYP450酶亚型。
　　方法：将间尼索地平和CYP450酶各亚型特异性抑制剂加入大鼠肝微粒体温孵液中共孵育，温孵条件基于前期报道并进行优化，温孵一定时间后，通过与不加入化学抑制剂的阴性对照溶液比较，检测间尼索地平对映体的剩余量，考察化学抑制剂对间尼索地平对映体代谢的影响。
　　结果：酮康唑（CYP3A特异性抑制剂）能显著的抑制R,S两种间尼索地平对映体的代谢，当其浓度达到100μmol/L，对两种间尼索地平对映体代谢的抑制率均达到最大，而其他CYP450特异性抑制剂对间尼索地平对映体的代谢均无明显的抑制作用。
　　结论：实验结果表明在大鼠肝微粒体中，CYP3A为间尼索地平对映体的主要代谢酶。
　　第二部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术的间尼索地平对映体体外代谢研究
　　目的：基于超高效液相色谱-四级杆-飞行时间质谱串联技术（UHPLC-Q-TOF），采用大鼠肝微粒体作为体外代谢反应模型，探讨间尼索地平对映体的体外代谢转化过程。
　　方法：将同等浓度的间尼索地平 R,S对映异构体分别置于体系中孵育。孵育完全后，将处理好的样品注入到 UHPLC-Q-TOF-MS/MS色谱-质谱联用仪进行数据采集。借助采集到的高分辨一级二级质谱数据，推测代谢产物的结构，阐述其代谢途径并比较其异同。
　　结果：通过与空白样品比较，结合对照品的裂解规律，共从温孵样品中共鉴定出34个代谢产物，其中R-间尼索地平样品中鉴定出18种代谢产物，S-间尼索地平样品中鉴定出16种代谢产物。
　　结论：通过对代谢产物的归纳总结，得到了间尼索地平的体外代谢规律，主要包括氧化反应、去氢反应和酯水解反应等。
　　第三部分基于体外模型的间尼索地平对映体对人肝CYP450酶的影响
　　目的：基于HepG2细胞系及人肝微粒体代谢体系，研究间尼索地平对映体对人肝细胞色素氧化酶 CYP450主要亚型 CYP1A2、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4的诱导或抑制作用。
　　方法：采用HepG2细胞株，加入不同浓度的间尼索地平对映体共温孵，采用Real-time PCR技术考察间尼索地平对映体对CYPs的mRNA表达的影响；参考FDA相关指导原则，采用CYP450酶特异性探针底物的特征代谢反应，建立了基于LC-MS的探针底物代谢物检测方法，用于间尼索地平对映体的体外抑制研究。
　　结果：Real-time PCR结果表明，与阴性对照组相比，在上述3种质量浓度下，R,S-间尼索地平对映体均对CYP1A2具有明显的诱导作用（P＜0.05）。R,S-间尼索地平对映体均对CYP2B6具有明显的抑制作用（P＜0.05）。在低浓度下，R,S-间尼索地平对映体均对CYP3A4具有明显的诱导作用（P＜0.05），但在中高浓度下，R-间尼索地平对映体均对CYP3A4具有明显的诱导作用（P＜0.05），而在中高浓度下，S-间尼索地平对映体对CYP3A4无明显作用。R,S-间尼索地平对映体均对CYP2D6无明显作用。
　　探针底物抑制结果表明， R,S-间尼索地平对映体均对CYP2C8、CYP2C9、CYP2D6、CYP3A4具有中等程度的抑制作用，而对CYP1A2、CYP2B6、CYP2C19没有抑制作用。
　　结论：间尼索地平对映体可能会对CYP450代谢酶产生影响，联合用药时应加以关注。
　　第四部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS的间尼索地平体内代谢轮廓研究
　　目的：分析间尼索地平在大鼠体内的代谢物，研究间尼索地平及其代谢物在大鼠体内的代谢规律，从而阐明间尼索地平的体内代谢转化途径。
　　方法：首先应用UHPLC-Q-TOF-MS/MS方法分析间尼索地平原药及已知代谢产物对照品的质谱裂解规律及色谱保留时间，以此作为间尼索地平大鼠体内代谢物分析鉴定的依据；健康雄性Sprague–Dawley(SD)大鼠，灌胃给予间尼索地平，给药剂量为10 mg/kg，给药后采用代谢笼收集尿液和粪便。采用液液萃取方法对样品进行处理，将处理好的样品注入到UHPLC-Q-TOF-MS/MS仪，以多种数据采集模式进行数据采集；通过获得的代谢物质谱信息，采用多种数据后处理策略推测及确认代谢物结构，根据得到的代谢物结构和类型阐明间尼索地平在大鼠体内的代谢途径。
　　结果：通过与空白样品比较，结合对照品的裂解规律，从样品中共鉴定出25个代谢产物。
　　结论：该实验反映了间尼索地平的体内代谢规律，间尼索地平的主要代谢途径包括氧化反应、去氢反应、酯水解反应，还原反应和甲基化反应等。
　　第五部分基于 UHPLC-Q-TOF/MS技术的间尼索地平对大鼠肝脏CYP450酶活性的影响
　　目的：采用cocktail探针底物法，研究间尼索地平对大鼠肝细胞色素氧化酶CYP450亚型CYP1A2、CYP2B、CYP2C11、CYP2D1、CYP3A1活性的影响。
　　方法：建立基于UHPLC-Q-TOF/MS技术的体内探针底物检测方法；将SD大鼠随机分成空白组、间尼索地平低、中、高剂量组。采用CMC-Na溶液配制间尼索地平低、中、高剂量溶液，灌胃给药，1日1次，连续15天。并建立基于LC-MS的体内探针底物检测方法，通过给予低剂量探针药物，测定药代动力学参数，间接考察间尼索地平对大鼠肝脏细胞色素CYP450酶的影响。
　　结果：建立的体内探针检测方法快速、准确、灵敏度高、专属性强；研究发现不同剂量的间尼索地平长期给药后对大鼠CYP1A2、CYP2B、CYP2C11、CYP2D1和CYP3A1代谢酶的活性具有显著影响。
　　结论：长期给予间尼索地平可能会对CYP450代谢酶产生影响，联合用药时应加以关注。

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引言

第一部分基于HPLC-Q-TRAP/MS的间尼索地平对映体的代谢表型研究

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术的间尼索地平对映体体外代谢研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分基于体外模型的间尼索地平对映体对人肝CYP450酶的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分基于UHPLC-Q-TOF-MS/MS的间尼索地平体内代谢轮廓研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第五部分基于UHPLC-Q-TOF/MS技术的间尼索地平对大鼠肝脏

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述: 人类细胞色素P450家族主要代谢亚型相关研究

致谢

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