肾间质纤维化的“浊毒致瘀”病机学说及益气化瘀解毒中药保护作用的研究

摘要

目的：慢性肾脏病(CKD)在我国疾病谱中长期占据着主要的位置，严重危害人类的健康质量。而各类慢性肾脏病进展中均可见肾间质纤维化。当前大量的临床及实验结果表明肾间质纤维化程度与患者肾功能及预后密切相关。因此及时有效地减少间质的炎性细胞浸润，减轻其导致的炎性反应，防止间质纤维化的发生与发展，这是延缓肾功能向恶化的方向进展，改善患者预后的重要手段。
　　肾间质纤维化的形成过程中肾间质炎性细胞的浸润、炎症性反应、肾小管足细胞受损、表型转化，肾间质成纤维细胞的活化与增殖和细胞外基质的过度沉积可导致间质瘢痕硬化的形成。而这其中炎性损伤诱导细胞增殖在肾间质纤维化进展中起着重要作用。
　　在前期研究化瘀涤痰通络中药调控肾上腺髓质素(Adrenomendullin, ADM)抑制细胞表型转化的过程中，发现对于肾间质纤维化病变，单纯抑制细胞的表型转化尚难以减缓疾病的进展，而炎性损伤诱导细胞增殖在纤维化的形成中发挥着重要作用。结合肾病后期脾肾亏虚、湿浊毒邪内蕴的病机学说和“久病入络”的理论，发现梗阻性肾病存在明显的炎性损伤和细胞增殖，基于慢性肾病后期多见“脾肾亏虚，湿浊毒邪内蕴”和“久病入络”的病机，因而提出“浊毒致瘀”的假说。
　　本研究以单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)的方法诱导醛固酮活化—炎性介质高表达—信号转录—细胞增殖—细胞外基质积聚为路径，结扎野生型(Wide Type,WT)小鼠和ADM基因敲除小鼠单侧输尿管以复制肾间质纤维化模型，同时给予依普利酮和益气化瘀解毒中药汤剂进行研究性治疗，观察梗阻因素诱导醛固酮活化通过 SGK-1/NF-кB信号通路诱导纤维化进展，以及影响 MAPK通路中蛋白激酶 ERK(extracellular regulated protein kinases)的磷酸化，使得核转录因子NF-κB活化，刺激细胞增殖并分泌过多的细胞外基质形成纤维化的病理改变，以探讨炎性介质(浊毒)诱导细胞增殖形成纤维化(瘀)的机制和信号传导途径。同时观察ADM对细胞增殖的影响以及益气化瘀解毒中药的调控靶点，为“浊毒致瘀”假说的提出及益气化瘀解毒中药的临床应用提供实验依据。
　　第一部分肾间质纤维化的“浊毒致瘀”病机学说的提出及益气化瘀解毒中药的保护作用
　　方法：根据有肾间质纤维化的多种肾脏慢性疾病进行到后期共同的病理过程，病症表现与相应的中医病症的范畴匹配，查阅古代医籍文献，结合中医理论、现代中药药理研究与长期临床实践，总结、提炼“浊毒致瘀”的实验、临床与治疗依据，以及中医药在治疗肾间质纤维化的实验研究和临床应用方面的主要作用。将64例难治性肾病综合征患者分为治疗组和对照组各32例，对照组按照强的松标准疗程给予；治疗组在对照组基础上加服益气化瘀解毒中药，持续半年以上。两组患者在治疗结束后分别观察观察疗效、24h尿蛋白定量(URPO)、血清白蛋白(ALB)、总胆固醇(CHOL)、甘油三脂(TG)血纤维蛋白原(FIB)及部分凝血酶原时间(APTT)的变化。
　　结果：总结并提出了肾间质纤维化的“浊毒致瘀”病机学说，同时针对“浊毒致瘀”的病机，确立益气化瘀解毒治法，在实验研究和临床应用中初识益气化瘀解毒中药对于肾间质纤维化的保护作用机制。两组治疗前后自身比较，治疗组24h尿蛋白、胆固醇、甘油三酯及血纤维蛋白原较治疗前显著降低（P<0.05），而血清白蛋白和部分凝血酶原时间较治疗前明显升高（P<0.05）；对照组24h尿蛋白、胆固醇及血纤维蛋白原较治疗前显著降低（P<0.05），而血清白蛋白和部分凝血酶原时间较治疗前明显升高（P<0.05）；两组治疗后比较，治疗组24h尿蛋白、胆固醇、甘油三酯及血纤维蛋白原较对照组显著降低(P<0.05），而血清白蛋白和部分凝血酶原时间较对照组明显升高（P<0.05）。
　　第二部分肾上腺髓质素基因敲除小鼠的繁殖与鉴定
　　方法：选用 C57BL/6纯系雌性野生小鼠和肾上腺髓质素基因敲除小鼠按照SPF(无特定病原体)级动物饲养标准进行饲养。适应性喂养结束后，将1只雄鼠和2只雌鼠合笼进行繁殖。杂交繁殖后经基因鉴定筛选出的三个月龄雄性肾上腺髓质素基因敲除杂合子小鼠与纯系雌性野生小鼠合笼，待实验小鼠成熟后分组繁殖，雌性小鼠一旦怀孕立即记录父系来源并分笼。提取小鼠尾部组织DNA基因组，通过PCR进行扩增，而后进行2％琼脂糖凝胶电泳，以鉴定并筛选出本实验所用ADM基因敲除小鼠。
　　结果：小鼠尾部组织琼脂糖凝胶电泳基因型片段显示ADM基因敲除小鼠基因型杂合子(+/-)为双道，按此类基因条带可以鉴别出肾上腺髓质素(ADM)基因敲除小鼠。
　　第三部分益气化瘀解毒中药对野生型和ADM基因敲除型肾间质纤维化小鼠肾脏组织形态学、醛固酮及细胞增殖的影响
　　方法：野生型(WT)及ADM基因敲除型(AMKO)小鼠全部采取随机分组， WT型小鼠四组分别为假手术组(WT-Sham group)、模型组(WT-UUO group)、依普利酮组(WT-UUOE group)及中药治疗组(WT-UUOZ group)四组；AMKO型小鼠四组分别为假手术组(AMKO-Sham group)、模型组(AMKO-UUO group)、依普利酮组(AMKO-UUOE group)及中药治疗组(AMKO-UUOZ group)四组。以上各组仅假手术组采用切开并游离左侧输尿管但不结扎的方法，其余的各组则施以左侧输尿管结扎术。两中药治疗组给予益气化瘀解毒中药汤剂(黄芪20g、丹参20g、醋鳖甲、僵蚕、乌梢蛇、地龙、赤芍、黄芩、金银花、蒲公英、大黄各10g，以上药物按照成人一日剂量50kg体重一日用量折算)6.5g/kg?d以口灌服；两个依普利酮治疗组则采用依普利酮混匀于饲料后按照100mg/kg?d剂量进食。两假手术组和两模型组通过经口灌服与中药治疗组中药汤剂等剂量的生理盐水。连续观察实验各组小鼠的一般情况，给药持续10天。在实验结束时，采用小鼠眼球摘除取血，在使用离心机分离血清后，分别测定小鼠的血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、醛固酮(Ald)；摘取左侧肾脏，进行肾脏组织HE、MASSON染色，观察组织病理学改变；采用免疫组化法检测各组小鼠肾脏中PCNA的表达。
　　以上数据资料均以均数±标准差(mean±S.D.)表示，使用SPSS17.0统计软件进行统计，采用单因素方差分析(ANOVA)和卡方检验(Chi-square test)分析。差异水平以0.05和0.01做为检验标准。
　　结果：
　　1实验小鼠一般情况观察结果
　　实验过程中，两假手术组小鼠饮食饮水情况与其余各组无明显异常，手术切口均愈合良好。实验结束时，摘取各组小鼠左侧肾脏，观察显示两假手术组小鼠肾脏形态颜色均与正常小鼠一致，两模型组可见肾脏体积明显增大伴有积水，颜色由正常的鲜红色变为黄色，甚则暗褐色：两依普利酮组和中药组肾脏体积也有增大，但较模型组相对较小，积水量少，颜色呈现暗红色。
　　2小鼠肾组织病理形态学检测结果
　　HE染色显示，两型小鼠的假手术组均未观察到明显的异常。WT和AMKO两型小鼠模型组可见明显的肾小管上皮细胞的水肿，变性坏死以及缺失，有的萎缩程度较甚，在肾间质区可观察到有大量的炎性细胞的浸润，ADM基因敲除小鼠模型组尤甚。两型小鼠的依普利酮治疗组及中药治疗组的病理损伤程度与模型组比较减轻，同时可见基因敲除小鼠损伤重于野生小鼠。Masson染色结果可见，WT小鼠与AMKO小鼠的假手术组肾脏结构基本正常，仅有少量胶原成分出现于肾间质，肾小管的基底膜具有较好的完整性。WT和AMKO小鼠模型组的肾脏结构被破坏，肾小管基底膜严重变薄，同时可见有部分小管呈现出扩张现象，胶原成分以条带样或灶状大量沉积于肾间质，AMKO型小鼠的损伤重于WT型小鼠。两型小鼠的依普利酮治疗组及中药治疗组肾间质胶原成分的聚集较模型组均有明显减轻的趋势。
　　3肾功能检测结果
　　BUN检测结果显示，野生小鼠与 ADM基因敲除小鼠模型组与同类型小鼠假手术组比较有统计学意义(P<0.05)，野生小鼠与ADM基因敲除小鼠的依普利酮治疗组和中药治疗组与同类型小鼠模型组比较有统计学意义(P<0.05)，野生小鼠中药治疗组与ADM基因敲除小鼠的中药治疗组比较有差异(P<0.05)。Scr检测结果显示，野生小鼠与ADM基因敲除小鼠模型组与同类型小鼠假手术组比较有统计学意义(P<0.05)，野生小鼠与ADM基因敲除小鼠的依普利酮治疗组和中药治疗组与同类型小鼠模型组比较有统计学意义(P<0.05)，野生小鼠中药治疗组与ADM基因敲除小鼠的中药治疗组比较有差异(P<0.05)。
　　4醛固酮检测结果
　　Ald检测结果显示，野生小鼠与ADM基因敲除小鼠模型组与同类型小鼠假手术组比较有统计学意义(P<0.05)，野生小鼠与ADM基因敲除小鼠的依普利酮治疗组和中药治疗组与同类型小鼠模型组比较有统计学意义(P<0.05)，野生小鼠依普利酮组与ADM基因敲除小鼠依普利酮治疗组比较有差异(P<0.05)，野生小鼠中药治疗组与ADM基因敲除小鼠的中药治疗组比较有差异(P<0.05)。
　　5对细胞增殖的影响
　　PCNA检测结果显示，在假手术组的小鼠肾小管上皮细胞中观察到极少数目的PCNA阳性细胞，而在UUO小鼠的远端肾小管其表达显著增加。与UUO小鼠相比，PCNA阳性细胞在两个依普利酮治疗组及中药组中均减少。与WT小鼠相比，阳性细胞的数目在ADM基因敲除小鼠的模型组、依普利酮处理组及中药组中明显增加。其中，野生小鼠与ADM基因敲除小鼠模型组与同类型小鼠假手术组比较有统计学意义(P<0.05)，野生小鼠与ADM基因敲除小鼠的依普利酮治疗组和中药治疗组与同类型小鼠模型组比较有统计学意义(P<0.05)，野生小鼠依普利酮组与ADM基因敲除小鼠依普利酮治疗组比较有差异(P<0.05)，野生小鼠中药治疗组与ADM基因敲除小鼠的中药治疗组比较有差异(P<0.05)。
　　第四部分益气化瘀解毒中药对野生型和ADM基因敲除型肾间质纤维化小鼠SGK-1、NF-кB(P65)、ERK、P-ERK及ADM的影响
　　方法：动物分组情况、模型制作及给药方法与第二部分相同，实验过程共10天。实验结束后摘取小鼠的左侧肾脏，采用Western-Blot和免疫组化法对各组小鼠肾脏SGK-1、NF-кB(P65)、ERK、P-ERK及ADM的表达进行检测。统计学方法同第二部分。
　　结果：
　　1 Western Blot检测SGK-1、NF-кB、ERK、P-ERK及ADM的表达
　　1.1 Western Blot检测SGK-1的表达
　　应用Western Blot检测SGK-1蛋白表达情况，半定量结果显示，野生及 ADM基因敲除两假手术组小鼠肾组织 SGK-1有表达极少，两模型组表达明显高于同型小鼠的假手术组(P＜0.05)，AMKO模型组的表达高于WT小鼠模型组(P＜0.05)。两型小鼠的依普利酮治疗组和中药治疗组相较于同型小鼠模型组降低显著(P＜0.05)。WT小鼠和AMKO小鼠同种处理方法组间比较，AMKO型小鼠中药治疗组和依普利酮治疗组与WT型小鼠两处理组间无明显差异(P均>0.05)。
　　1.2 Western Blot检测NF-кB的表达
　　应用Western Blot检测NF-кB蛋白表达情况，半定量结果显示，WT及AMKO两型假手术组小鼠肾组织NF-кB表达量极少，两型小鼠的模型组表达增强，较同型假手术组明显升高(P＜0.05)，AMKO模型组 NF-кB的表达高于WT小鼠模型组(P＜0.05)。两型小鼠的依普利酮治疗组和两中药治疗组均低于同型小鼠的模型组(P＜0.05)。WT小鼠和AMKO小鼠同种处理方法组间比较，AMKO型小鼠的中药治疗组和依普利酮治疗组与WT型小鼠的两处理组存在明显差异(P均＜0.05)。
　　1.3 Western Blot检测P-ERK的表达
　　应用Western Blot检测P-ERK蛋白表达情况，半定量结果显示，WT及AMKO假手术组小鼠的P-ERK表达量极少，WT和AMKO小鼠的模型组表达增强，显著高于同种类型小鼠的假手术组(P＜0.05)，同时可见到AMKO的模型组高于WT小鼠模型组(P＜0.05)。两型小鼠的依普利酮治疗组及两中药治疗组P-ERK的表达低于同类型的小鼠模型组(P＜0.05)。WT型小鼠和AMKO型小鼠同种处理方法组间比较，AMKO型小鼠的中药治疗组和依普利酮治疗组与 WT型小鼠两处理组间存在明显差异(P均＜0.05)。
　　1.4 Western Blot检测P-ERK/ERK的表达
　　应用Western Blot检测ERK蛋白表达情况，后将P-ERK与ERK进行比值处理，结果显示WT及AMKO小鼠P-ERK/ERK在模型组中上升，明显高于同类型小鼠的假手术组(P＜0.05)，同时发现AMKO小鼠模型组高于WT小鼠模型组(P＜0.05)。两型小鼠依普利酮治疗组和中药治疗组则低于同种类型小鼠的模型组(P＜0.05)。WT型小鼠和AMKO型小鼠同种处理方法组间比较，AMKO型小鼠的中药组和依普利酮组与WT型小鼠两处理组不存在明显差异(P均>0.05)。
　　1.5 Western Blot检测ADM的表达
　　应用Western Blot检测ADM蛋白表达情况，半定量结果显示，野生及ADM基因敲除两假手术组小鼠肾组织ADM蛋白大量表达，两模型组表达显著低于同型假手术组(均有 P＜0.01)，同时可见 ADM基因敲除模型组低于野生小鼠模型组(P＜0.05)。野生假手术组明显高于ADM基因敲除假手术组(P＜0.05)，两型小鼠的依普利酮治疗组和中药治疗组明显高于同类型模型组(P＜0.05)。WT及AMKO小鼠同型之间中药组与依普利酮组不存在差异(P均>0.05)。WT小鼠依普利酮组与 AMKO小鼠依普利酮治疗组比较有差异(P<0.05)，WT小鼠中药治疗组与AMKO小鼠的中药治疗组比较有差异(P<0.05)。
　　2免疫组化检测SGK-1、NF-кB及P-ERK的表达
　　2.1免疫组化检测SGK-1的表达
　　光镜观察结果显示，WT及AMKO假手术组小鼠的SGK-1基本无阳性表达，在肾小球、小管和间质部无表达；两型小鼠的模型组中 SGK-1在集合管的上皮细胞胞质中呈现增多的趋势，有些肾小管的上皮细胞以及周围的间质区域中SGK-1表达显著，AMKO模型组表达尤其明显。两型小鼠的依普利酮治疗组及中药治疗组SGK-1表达较同型模型组明显减少。
　　2.2免疫组化检测NF-кB的表达
　　光镜下WT及AMKO假手术组小鼠阳性表达基本不可见，在肾小球、小管及间质部亦无表达；WT和AMKO两型小鼠的模型组中NF-кB在肾皮质的近端小管的细胞质中表达出现明显的增多，其中尤其以AMKO模型组表达较为明显。两类型小鼠的依普利酮治疗组及中药治疗组 NF-кB表达较同型模型组明显减少。
　　2.3免疫组化检测P-ERK的表达
　　WT和AMKO假手术组小鼠P-ERK极少表达，仅存在于肾小球和小管处；WT及AMKO模型组的表达可见于肾小管的上皮细胞，髓质区表达明显增强，ADM基因敲除小鼠尤其明显；WT和AMKO的依普利酮治疗组与中药治疗组的表达相对于同类型小鼠的模型组显著减少。但两组中ADM基因敲除小鼠较野生小鼠损伤更为严重。
　　结论：
　　1“浊毒致瘀”是慢性肾脏病的重要病机。
　　2 梗阻性肾病可激活醛固酮，诱导炎症损伤，刺激细胞增殖，参与肾间质纤维化。
　　3 ADM参与肾间质纤维化的进展，益气化瘀解毒中药拮抗肾间质纤维化与调控ADM相关。

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引言

第一部分肾间质纤维化的“浊毒致瘀”病机学说的提出及益气化瘀解毒中药的保护作用

(一)“虚”是疾病发生的理基础

(二)“毒”是疾病进展的关键所在

(三)“瘀”是肾病日久的必然结果

（四）益气化瘀解毒治法的提炼及依据

(附篇)基于“浊毒致瘀 ”病机学说探讨益气化瘀解毒中药治疗难治性肾病综合征疗效的临床观察

第二部分肾上腺髓质素基因敲除小鼠的繁殖与鉴定

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分益气化瘀解毒中药对野生型和ADM基因敲除型肾间质纤维化小鼠肾脏组织形态学、醛固酮及细胞增殖的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第四部分益气化瘀解毒中药对野生型和ADM基因敲除型肾间质纤维化小鼠SGK-1、NF-кB(P65)、ERK、P-ERK及ADM的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述一: 肾间质纤维化机制的研究进展

综述二: 中医药防治肾间质纤维化研究新进展

致谢

个人简历