法舒地尔对UUO大鼠模型IKKβ、IκBα、NF-κBP65及Ⅲ型胶原表达的影响

摘要

目的：肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病（Chronic Kidney Disease，CKD）进行性进展的共同病理基础，其病理学变化是细胞外基质(extracellular matrix，ECM)的过多沉积，进而导致肾结构的破坏及肾功能的下降。多种细胞、细胞信号转导通路及细胞因子均参与该过程。肾间质纤维化的早期表现为以巨噬细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润，细胞因子、趋化因子增加为主的炎症状态。在炎症反应中产生的多种细胞因子、生长因子及趋化因子及均可作用于成纤维细胞（fibroblasts,FB）引起 FB增生活跃以及诱导其发生表型转化，使其合成胶原蛋白能力增加，导致细胞外基质过度沉积，造成肾脏结构重塑，促进肾间质纤维化。核因子-κB（nuclear factor-κB，NF-κB）是一种很重要的转录因子，在各种细胞外刺激介导的细胞信号转导调控中起核心作用，研究发现多种细胞因子、生长因子及趋化因子的基因表达是通过该因子转录机制来调节的，在肾间质纤维化过程中，能促进多种细胞因子、生长因子及趋化因子的基因转录，进而作用于FB，介导和促进肾间质纤维化的发生和发展。NF-κB的活化主要依赖于经典途径：这种途径依赖IKK（IκB kinase）多聚体磷酸化IκBα(NF-κB抑制蛋白)，再通过泛素化降解IκBα，使NF-κB二聚体得以释放，核转位进入细胞核，启动下游基因转录，TNF-α等促炎细胞因子可激活此途径。IKK是一个大的多组分蛋白激酶复合体（＞700KDa），它包括四个组分，即具有催化活性的IKKα/IKK1、IKKβ/IKK2，和两个辅助蛋白IKKγ/NEMO、IKAP。其中IKKβ是激活NF-κB经典途径的关键亚基，IKKβ可以使IκBα上Ser32和Ser36磷酸化，并诱导其降解，使NF-κB从复合体中解离后转位至细胞核启动下游基因转录。法舒地尔是一种新型异喹啉磺胺衍生物，是目前应用于临床的 Rho激酶抑制剂，其具有扩张血管、减少炎症反应、抑制自由基生成等作用，目前广泛应用于心脑血管疾病的治疗。有研究显示：肾间质纤维化中，法舒地尔作为Rho激酶抑制剂通路阻断Rho-ROCK通路对肾间质纤维化的保护作用已被研究，有研究显示其作为异喹啉类抑制剂作用于激酶催化结构域的ATP结合位点发挥作用，对其它蛋白激酶也具有选择性抑制作用，但报道不多，本实验目的是通过建立单侧输尿管梗阻大鼠模型(unilateral ureteral obstruction,UUO)，并应用法舒地尔进行干预观察其对IKKβ、IκBα、NF-κBP65、Ⅲ型胶原表达的影响，探讨法舒地尔保护肾脏，延缓肾间质纤维化的可能机制，为延缓及治疗肾间质纤维化提供新的靶点。
　　方法：将54只SPF级雄性SD大鼠(体重180g±20g)编号后按照随机原则分为三组：A组(假手术组，正常对照组)，B组(单侧输尿管结扎组，模型组)，C组(法舒地尔组，治疗组)，每组各18只。适应性喂养1周后进行手术建立单侧输尿管梗阻大鼠模型，术前12小时各组大鼠禁食水。三组大鼠均于术前1天开始给药,C组给予法舒地尔注射液10mg/（Kg·d）腹腔注射；A组及 B组每天给予等容积的0.9％氯化钠注射液腹腔注射。自由摄食水，分别于术后第3、7、14天处死6只大鼠，留取左肾标本，0.9%生理盐水充分冲洗后取中间1/4固定于4%多聚甲醛中，用于病理切片，应用HE和Masson染色技术观察光镜下大鼠肾组织病理改变及肾间质纤维化程度，并应用免疫组化技术测定IKKβ、IKBα、NF-KBP65及Ⅲ型胶原在肾脏组织中的表达。另取部分肾脏组织放入液氮并转移至-80℃超低温冰箱保存，用于行western blot检测 NF-κBP65蛋白的表达。所得实验数据用SPSS20.0统计分析软件进行统计学处理，以均数±标准差(x±S)表示统计结果，应用单因素方差分析对数据进行分析，P<0.05表示结果有统计学意义。
　　结果：
　　1.大鼠肾脏组织病理学改变
　　1.1 肉眼
　　A组肾脏颜色及大小正常，其余各组大鼠肾脏体积均有不同程度增大，输尿管扩张，肾皮质变薄，肾脏及输尿管内有尿液积聚，其中以B组肾脏病变最为明显。
　　1.2 光镜下HE染色
　　A组：肾组织结构正常，肾小管及间质未见明显异常。B组：术后第3天，少量炎症细胞局部浸润于肾间质区域，肾小管轻度扩张，无明显纤维组织异常增生；第7天，肾间质有大量炎症细胞浸润，肾小管扩张明显，并可见肾小管萎缩、塌陷，纤维组织异常增生；第14天，可见更多肾小管萎缩，基底膜完整性破坏。C组：术后随时间延长，肾小管间质病变逐渐加重，和同期B组相比，肾小管间质病变程度有所减轻，但仍明显重于同期A组。
　　1.3 光镜下Masson染色
　　A组：肾组织相对完整，仅个别区域有少量胶原纤维。B组：术后第3天可见肾小管轻度扩张，肾间质可见少量蓝色胶原纤维沉积，相较于同期A组增多；术后第7天，肾小管扩张明显，并可见萎缩肾小管，蓝色胶原纤维沉积较术后3天增多；术后14天可观察到蓝色胶原纤维沉积明显，并且相互交织成网状。C组：术后随时间延长，肾小管间质病变及胶原纤维表达水平进行性加重、增多，较同期 B组的病变程度稍轻，但仍明显重于A组。
　　2.免疫组化结果
　　显微镜下观察发现，IKKβ、IκBα、NF-κBP65、Ⅲ型胶原在各组肾小管上皮细胞及肾间质呈阳性表达，其中NF-κBP65在分析中均针对细胞核中因子的表达变化。由图像分析结果可见 B组 IKKβ、NF-κBP65、Ⅲ型胶原在术后3天、7天、14天在肾小管上皮细胞及肾间质表达量逐渐增加（P均<0.05），各因子分别与同期A组相比表达增加（P均<0.05）；B组IκBα随梗阻时间延长，在肾间质表达量逐渐减少（P均<0.05），与同期A组相比表达减少（P均<0.05）。C组IKKβ、NF-κBP65、Ⅲ型胶原在肾间质表达随时间延长也逐渐增加（P均<0.05），分别与同期B组相比各因子表达减少（P均<0.05），但与同期A组相比，表达增加（P均<0.05）；C组IκBα在肾间质表达随梗阻时间延长逐渐减少（P均<0.05），与同期B组相比各因子表达增多（P均<0.05），与同期A组比较，表达减少（P均<0.05）
　　3.western Blot结果
　　NF-κBP65蛋白：B组目的蛋白的表达量随时间延长逐渐增加（P均<0.05），与同期A组相比表达量增加（P均<0.05）；C组术后各时期目的蛋白表达量随时间延长逐渐增加（P均<0.05），与同期B组相比较表达量减少（P均<0.05），但仍高于同期A组（P均<0.05）。
　　结论：
　　1.IKKβ、NF-κBP65、Ⅲ型胶原在UUO模型梗阻侧肾脏组织中的表达量增加，且与时间延长呈正相关，而IκBα呈相反变化，提示在肾间质纤维化过程中，NF-κB通路被激活，进一步介导和促进肾间质纤维化的进展。
　　2.法舒地尔可能通过抑制IKKβ表达，减少IκBα的磷酸化及解离，下调NF-κBP65的表达，进而减轻Ⅲ型胶原在肾脏的沉积及表达，从而发挥保护肾脏，延缓肾间质纤维化进展的作用。

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前言

材料与方法

1 实验材料

1.1 实验动物

1.2 主要仪器

1.3 主要试剂

1.4 药物

1.5 试剂配制方法

2 实验方法

2.1实验分组级手术建立UUO大鼠模型

2.2 大鼠饲养环境及一般情况观察

2.3 干预药物

2.4 给予各组大鼠腹腔注射给药

2.5 标本收集及处理

2.6 石蜡包埋和制片

2.7病理染色

2.8 免疫组化

2.9 Western Blot

结果

1 肾脏组织病理变化

1.1肉眼

1.2光镜下 HE染色

1.3 Masson染色

2 免疫组织化学

2.1 IKKβ表达结果

2.2 IκBα表达结果

2.3 NF-κBP65表达结果

2.4 Col-Ⅲ表达结果

3 western Blot结果

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述: Rho小G蛋白与肾间质纤维化的研究进展

致谢

个人简历

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