PNPLA3基因单核苷酸多态性及基因表达与乙肝病毒感染易感性及乙肝相关肝细胞癌的关联性研究

摘要

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）位居全球恶性肿瘤发病率第六位，每年有748300新发病例；死亡原因占第三位，每年有695900死亡病例。我国更是 HCC的高发区，HCC患者占全世界的50％以上。每年全球超过50%的 HCC新发病例发生在中国。在我国内地，最近5年 HCC是位居死因第二位的恶性肿瘤，乙型肝炎病毒（hepatitis B virus， HBV）的慢性感染是 HCC最主要的危险因素，近80%-90%HCC患者的HBV指标呈阳性。目前我国约有1亿的HBV慢性感染者，占全球的1/3，而 HCC占全球一半以上。其中3000万是活动性乙肝患者。据推测，HBV慢性感染者中约有25~40%将最终进展为 HCC。HBV感染后可出现不同的疾病转归，如无症状携带者（ asymptomatic HBsAg carriers， ASCs）或隐匿性肝炎、急性肝炎、慢性乙型肝炎（ chronic hepatitis B, CHB）、肝硬化（liver cirrhosis，LC）或HCC，这些不同的肝脏疾病谱主要与病毒、环境和宿主遗传因素有关。宿主的遗传因素如易感基因多态性，即单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism， SNP）也在HCC的发生发展中起到一定作用。
　　国内外许多研究已报道了一系列和肝癌发生或乙肝病毒持续感染相关的 SNP位点，但是发现的 HBV-HCC遗传易感性位点却较少。脂肪滋养蛋白（patatin-like phospholipase domain-containing3，PNPLA3）基因在脂肪和肝脏中高表达，具有脂肪水解和合成功能。目前国内外有大量研究集中在 PNPLA3基因各位点多态性与肝病的相关性分析。如多项研究发现，PNPLA3 rs738409多态性参与了很多肝病的疾病进程。此多态性与酒精性肝病（alcoholic liver disease, ALD）、LC有关，并加剧了慢性丙型肝炎（ chronic hepatitis C, CHC）患者的肝脂肪变和纤维化进程。2013年 Valenti L等发现 PNPLA3 rs2294918与非酒精性脂肪肝（ nonalcoholic fatty liver disease， NAFLD）有关。Pan Q等研究发现PNPLA3 rs738408影响CHB的发生。近期研究发现PNPLA3 rs738409、rs2281135是LC的危险因素。
　　本研究将探讨和揭示 PNPLA3基因多态性（ rs738408、rs738409、rs2294918、rs2294919和rs2281135）与HBV慢性感染及HBV-HCC的发生发展过程中宿主遗传易感性发挥的作用。
　　第一部分：PNPLA3基因单核苷酸多态性及基因表达的分布特征
　　目的：
　　探讨 PNPLA3基因（rs738408、rs738409、rs2294918、rs2294919和rs2281135）5个 SNP位点在我国汉族居民的不同人群中的分布特点和规律。
　　方法：
　　符合纳入条件的研究对象共2410例，分为5个亚组，其中包括健康体检者370例、HBV自然清除（ NC）者248例、慢性HBV感染（ CIB）者（慢性乙型肝炎（CHB）691例和肝硬化（LC）680例）1371例和HBV相关性肝癌（HCC）患者421例。采用调查问卷收集研究对象的一般资料，收集外周静脉血5ml，提取其DNA，运用美国 SEQUENOM公司MassARRAY时间飞行质谱技术进行基因分型检测。采用K-W H秩和检验或?2检验比较5个SNP位点不同基因型在多组间的分布情况，由IBM SPSS22.0统计软件完成数据分析。
　　结果：
　　1基因分型的检测成功率均高于97%，说明整个实验操作过程质量控制得当，步骤合理。
　　2研究对象的一般特征
　　年龄在各组间均有统计学差异（0.001485.803,2?? P?）。HCC组年龄最高，平均为57.32±8.96岁；LC组平均年龄为52.70±10.78岁， NC组平均年龄为50.13±15.13岁，健康对照组平均年龄为48.24±14.64岁，年龄依次递减；CHB组平均年龄为39.93±13.21岁，年龄最低。性别在各组间的分布总的来说有统计学差异（0.00153.446,2?? P?）。HCC组男性比例最高，为77.6%，高于其他各组；LC组和 CHB组男性比例较高，其中LC组为69.4%，CHB组为67.4%；NC组和健康对照组的男性比例最低，其中NC组为58.5%，健康对照组为55.4%。各组的吸烟率有统计学差异（0.00143.599,2?? P?），其中HCC组吸烟率高于其他各组，为37.1%；而LC组、CHB组、NC组和健康对照组的吸烟率无统计学差异（22.5%、22.3%、20.2%和21.4%）。各组的饮酒率亦有统计学差异（0.00135.325,2?? P?）。HCC组饮酒率高于其他各组，为39.0%；而 LC组、CHB组、NC组和健康对照组的饮酒率无统计学差异（25.1%、24.3%、24.6%和24.1%）。CHB、LC和 HCC三组的 TBIL、DBIL、IBIL、TP、ALB、GLB、A/G、ALT、AST和 ALT/AST有统计学差异（P<0.001）。
　　3 PNPLA3各多态性位点不同基因型的分布特征
　　PNPLA3 rs738408 TC基因型的年龄低于 CC/TT基因型（P=0.049）；PNPLA3基因的5个多态性位点的不同基因型在不同变量上均未见统计学差异，包括年龄、性别、吸烟情况、饮酒情况以及各项实验室检查指标（TBIL、IBIL、TP、ALB、GLB、A/G、ALT、AST和AST/AST）（P>0.05）。
　　4 PNPLA3各多态性位点基因型频率在不同人群中的分布情况
　　在总人群中，PNPLA3 rs738408和rs2294918两个位点的基因型在健康对照、自然清除者、CHB、LC和 HCC患者中分布差异有统计学意义（P<0.001）。在女性人群中，rs738408和rs2294918两个位点的基因型在健康对照、自然清除者、CHB、LC和 HCC患者中分布差异有统计学意义（ rs738408：P=0.012， rs2294918：P=0.001）。在男性人群中， rs2294918位点的基因型在健康对照、自然清除者、CHB、LC和HCC患者中分布差异有统计学意义（P=0.026）。
　　结论：
　　1对健康对照、HBV自然清除、慢性乙型肝炎、乙肝肝硬化和肝细胞癌5个亚组的研究对象进行人口学和实验室指标进行分析，结果显示年龄、性别、吸烟和饮酒可能与慢性 HBV感染及 HBV相关肝细胞癌的发生有关。
　　2在总人群和女性人群中，rs738408和rs2294918的基因型在健康对照、自然清除者、CHB、LC和 HCC患者中分布有统计学差异；在男性居民中rs2294918的基因型在健康对照、自然清除者、CHB、LC和HCC患者中分布有统计学差异。
　　第二部分：PNPLA3基因多态性与HBV感染易感性的关联性分析
　　目的：
　　探讨 PNPLA3基因多态性（ rs738408、rs738409、rs2294918、rs2294919和rs2281135）与HBV慢性感染的相关性，分析PNPLA3遗传多态性与环境因素（如吸烟、饮酒）在慢性HBV感染中的交互作用。
　　方法：
　　采用病例对照研究方法，符合纳入条件的研究对象共2410例，分为2个亚组，其中病例组共1792例，包括慢性乙型肝炎患者691例，乙肝肝硬化患者680例和肝癌患者421例；对照组共618例，包括248例HBV自然清除者和370例健康人。采用调查问卷收集研究对象的一般资料，采集外周静脉血5ml，提取其DNA，运用美国 SEQUENOM公司MassARRAY时间飞行质谱技术进行基因分型检测。采用一般?2检验、Armitage趋势检验、多重Logistic回归分析和单倍型分析等统计分析方法，对PNPLA3基因多个SNP位点及HBV感染易感性的关联性进行分析并计算比值比（ odds ratio， OR）和其95%可信区间（95% confidence intervals，95%CI）。由IBM SPSS22.0统计软件和Haploview4.2软件完成数据分析。
　　结果：
　　1 PNPLA3各多态性位点基因型频率的分布与HBV感染的关系
　　以未感染 HBV人群作为对照，与 CC基因型相比，携带 PNPLA3 rs738408位点TC、TT或T等位基因显著降低HBV感染的风险（TC vs. CC：OR=0.558,95% CI=0.405-0.770；TT vs. CC：OR=0.659，95%CI=0.472-0.919；T vs. C：OR=0.638，95% CI=0.502-0.811）。与 GG基因型相比，携带PNPLA3 rs2294918位点AG基因型显著增加了HBV感染的风险（OR=1.363,95% CI=1.092-1.702），但携带此位点AA基因型却显著降低了HBV感染的风险（OR=0.511,95% CI=0.354-0.736）。未发现PNPLA3其他位点的基因型与HBV感染有关联。
　　按性别进行分层后，以女性未感染HBV人群作为对照，与 CC基因型相比，携带PNPLA3 rs738408位点TC基因型或T等位基因显著降低HBV感染的风险（ TC vs. CC：OR=0.428,95% CI=0.290-0.788；T vs. C：OR=0.594，95% CI=0.407-0.868）。与 GG基因型相比，携带PNPLA3 rs2294918位点 AA基因型显著降低了 HBV感染的风险（OR=0.467,95%CI=0.256-0.851）。未发现PNPLA3其他位点的基因型与HBV感染有关联。
　　以男性未感染 HBV人群作为对照，与 C等位基因相比，携带PNPLA3 rs738408位点 T等位基因显著降低 HBV感染的风险（OR=0.687，95%CI=0.501-0.944）。与GG基因型相比，携带PNPLA3 rs2294918位点 AG基因型显著增加了 HBV感染的风险（ OR=1.383,95% CI=1.037-1.843），但携带此位点 AA基因型却显著降低了 HBV感染的风险（OR=0.541,95%CI=0.338-0.866）。未发现PNPLA3其他位点的基因型与HBV感染有关联。
　　2 PNPLA3基因各SNP位点与HBV感染易感性的关联性分析
　　在控制了性别、年龄、吸烟和饮酒因素后，PNPLA3的 rs738408、rs738409、rs2294918和rs2294919位点均与HBV的易感性仍存在关联。携带rs738408 TC或TT基因型的个体感染HBV的风险降低，OR值分别为0.059和0.020（95%CI=0.028-0.125，P<0.001；95%CI=0.007-0.053， P<0.001）；携带 rs738409 GG基因型的个体感染 HBV的可能性为rs738409 CC基因型携带者的27.550倍（95% CI=10.024-75.718, P<0.001）；携带 rs2294918 AA基因型的个体感染 HBV的风险降低， OR值为0.354（95% CI=0.210-0.599，P<0.001）；携带rs2294919 TC基因型的个体感染 HBV的风险降低， OR值为0.598（95% CI=0.429-0.833， P=0.002）。男性感染 HBV的风险是女性的1.975倍（95%CI=1.572-2.480，P<0.001），尚未发现年龄、吸烟、饮酒与 HBV感染的相关性。
　　3基因与环境因素的交互作用分析
　　校正了性别、年龄因素后，PNPLA3基因的5个 SNP位点与吸烟或饮酒均未发现存在交互作用。
　　4单倍型分析
　　PNPLA3 rs2281135和rs2294919组成单体域（Haplotype block）1，但其单倍型AC、GT和GC在慢性HBV感染者和非慢性HBV感染者中无统计学差异（P>0.05）。
　　结论：
　　1不论是在总人群，还是男性或女性人群中，PNPLA3 rs738408位点TC、TT或T等位基因和rs2294918位点AA基因型均能降低HBV感染风险，而rs2294918位点AG基因型反而增加HBV感染的风险。
　　2在控制了性别、年龄、吸烟和饮酒因素后，PNPLA3基因各SNP位点与HBV感染易感性的关联性分析显示rs738408 TC或TT基因型、rs738409 GG基因型、rs2294918 AA基因型和rs2294919 TC基因型均与HBV感染有关，性别也是HBV感染的重要影响因素。
　　3校正了性别、年龄因素后，未发现PNPLA3基因的5个位点与吸烟、饮酒之间存在交互作用。
　　4 PNPLA3的两个位点 rs2281135和 rs2294919组成单体域，但其单倍型AC、GT和GC在慢性HBV感染者和非慢性HBV感染者中无统计学差异。
　　第三部分：PNPLA3基因多态性与乙肝相关肝细胞癌的关联性分析
　　目的：
　　探讨 PNPLA3基因多态性（ rs738408、rs738409、rs2294918、rs2294919和 rs2281135）与 HBV-HCC的相关性，分析 PNPLA3遗传多态性与环境因素（如吸烟、饮酒）在HCC发生中的交互作用。
　　方法：
　　采用病例对照研究方法，符合纳入条件的研究对象共2410例，病例组为421例HBV相关性肝癌（ HCC）患者，分别以370例健康体检者、248例HBV自然清除（NC）者、691例慢性乙型肝炎（CHB）患者和680例肝硬化（LC）患者为作为对照组。采用调查问卷收集研究对象的一般资料，采集外周静脉血5ml，提取其DNA，运用美国 SEQUENOM公司MassARRAY时间飞行质谱技术进行基因分型检测。采用一般?2检验、Armitage趋势检验、多重Logistic回归分析和单倍型分析等统计分析方法，对PNPLA3基因多个SNP位点及HBV相关性肝癌的关联性进行分析并计算比值比（ odds ratio， OR）和其95%可信区间（95% confidence intervals，95%CI）。由IBM SPSS22.0统计软件和Haploview4.2软件完成数据分析。
　　结果：
　　1 PNPLA3各多态性位点基因型频率的分布与乙肝相关肝细胞癌的关系
　　以健康人群作为对照，与 CC基因型相比，携带 PNPLA3 rs738408位点 TC或 T等位基因显著降低 HBV-HCC的风险（OR=0.412,95%CI=0.252-0.674；OR=0.538，95% CI=0.371-0.779）。与 GG基因型相比，携带 PNPLA3 rs2294918位点 AG基因型显著增加了 HBV-HCC的风险（ OR=1.621,95% CI=1.171-2.244）。与 CC基因型相比，携带PNPLA3 rs2294919位点 TC基因型显著降低了 HBV-HCC的风险（OR=0.710,95%CI=0.536-0.960）。未发现PNPLA3其他位点的基因型与HBV-HCC有关联。
　　以自然清除人群作为对照，与 GG基因型相比，携带 PNPLA3 rs2294918位点 AG基因型显著增加了 HBV-HCC的风险（ OR=1.534,95% CI=1.052-2.237），但 AA基因型却降低了 HBV-HCC的风险（OR=0.438,95%CI=0.236-0.812）。未发现PNPLA3其他位点的基因型与HBV-HCC有关联。
　　以非肝癌 HBV感染者（CHB、LC）作为对照，未发现 PNPLA3多态性与HCC的显著相关性。
　　2 PNPLA3基因各SNP位点与乙肝相关肝细胞癌的关联性分析
　　以 HBV-HCC为病例组，以健康者为对照组，在控制了性别、年龄、吸烟和饮酒因素后，PNPLA3的 rs2294918和 rs2294919位点均与HBV-HCC的发生风险存在关联。携带 rs2294918 AG基因型的个体患HBV-HCC的风险是 GG基因型的1.872倍（95% CI=1.256-2.791， P=0.002）；携带rs2294919 TC基因型的个体患HBV-HCC的风险降低， OR值为0.605（95% CI=0.413-0.886，P=0.010）。男性患 HBV-HCC的风险是女性的2.372倍（95% CI=1.613-3.490，P<0.001）；年龄增高，患HBV-HCC的风险大大升高，≥45岁人群患HBV-HCC的风险是<45岁人群的8.366倍（95% CI=5.393-12.975，P<0.001）；尚未发现吸烟、饮酒与HBV-HCC患病的相关性。
　　以HBV-HCC为病例组，以HBV自然清除者为对照组，在控制了性别、年龄、吸烟和饮酒因素后，PNPLA3的rs2294918与HBV-HCC的发生风险存在关联。携带rs2294918 AG基因型的个体患HBV-HCC的风险是 GG基因型的1.529倍（95% CI=1.004-2.329， P=0.048）。男性患HBV-HCC的风险是女性的1.891倍（95% CI=1.245-2.871，P=0.003）；年龄增高，患 HBV-HCC的风险大大升高，≥45岁人群患 HBV-HCC的风险是<45岁人群的6.159倍（95% CI=3.815-9.943，P<0.001）；尚未发现吸烟、饮酒与HBV-HCC患病的相关性。
　　以HBV-HCC为病例组，以CHB为对照组，在控制了性别、年龄、吸烟和饮酒因素后，PNPLA3的5个位点均与 HBV-HCC的发生风险无关联。男性患 HBV-HCC的风险是女性的1.867倍（95% CI=1.284-2.717，P=0.001）；年龄增高，患 HBV-HCC的风险大大升高，≥45岁人群患 HBV-HCC的风险是<45岁人群的20.952倍（95% CI=13.944-31.483，P<0.001）；尚未发现吸烟、饮酒与HBV-HCC患病的相关性。
　　以 HBV-HCC为病例组，以 LC为对照组，在控制了性别、年龄、吸烟和饮酒因素后，PNPLA3的5个位点均与 HBV-HCC的发生风险无关联。年龄增高，患 HBV-HCC的风险大大升高，≥45岁人群患 HBV-HCC的风险是<45岁人群的3.276倍（95% CI=2.150-4.990， P<0.001）；吸烟者患 HBV-HCC的风险是不吸烟者的1.541倍（95%CI=1.081-2.196，P=0.017）；尚未发现性别、饮酒与 HBV-HCC患病的相关性。
　　3基因与环境因素的交互作用分析
　　校正了性别、年龄因素后，以 CHB作为对照组，仅发现 PNPLA3 rs738409位点 GC基因型与吸烟在 HCC发病中存在交互作用，OR值为0.556（95% CI=0.309-0.998， P=0.049）。此外， PNPLA3基因的5个SNP位点与吸烟或饮酒均未发现存在交互作用。
　　4单倍型分析
　　以健康人群作为对照组， HCC作为病例组进行分析， rs738409和rs2281135组成Block1，rs2294918和rs2294919组成Block2；rs738409和 rs2281135组成的单体域中，其中单倍型 CA在 HCC患者和健康者中有统计学差异（0.01935.478,2?? P?）。未发现其他单体域的单倍型在组间有统计学差异。
　　结论：
　　1 PNPLA3 rs738408位点 TC或 T等位基因和rs2294919位点 TC基因型是健康人群患HBV-HCC的保护因素，而rs2294918位点AG基因型是危险因素。PNPLA3 rs2294918位点 AA基因型是 HBV自然清除者患HBV-HCC的保护因素，而 AG基因型是其危险因素。PNPLA3 rs2294918位点 AG基因型是女性慢性乙型肝炎患 HBV-HCC的危险因素。
　　2在控制了性别、年龄、吸烟和饮酒因素后，以健康人群为对照， PNPLA3的rs2294918和rs2294919位点均与HBV-HCC的发生风险存在关联；以 HBV自然清除者为对照组，PNPLA3的 rs2294918与 HBV-HCC的发生风险存在关联；以CHB或LC为对照组，PNPLA3的5个位点均与HBV-HCC的发生风险无关联。
　　3校正了性别、年龄因素后，发现 PNPLA3 rs738409位点 GC基因型与吸烟在 HCC发病中存在交互作用。未发现 PNPLA3基因的其他位点与吸烟、饮酒之间在肝细胞癌患病风险中存在交互作用。
　　4以健康人群作为对照组， PNPLA3的两个位点 rs738409和rs2281135组成单体域，其单倍型 CA在 HCC患者和健康者中有统计学差异。

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引言

第一部分PNPLA3基因单核苷酸多态性及基因表达的分布特征

前言

材料与方法

结果

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分PNPLA3基因多态性与HBV感染易感性的关联性分析

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分PNPLA3基因多态性与乙肝相关肝细胞癌的关联性分析

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述: 乙型肝炎病毒基因型和变异株的研究进展

致谢

个人简历