调节Kv7通道对VTA区DA能神经元兴奋性及动物抑郁样行为的作用及机制

摘要

抑郁症是一种严重的精神心理疾病，会给病人及其家庭造成非常大的伤害。全球抑郁症患者估计影响了全球20％的人口，世界卫生组织估计到2020年将成为威胁人类健康的第二大疾病。抗抑郁症药物自1950年问世以来取得了非常大的进展，但是现有抑郁药物（包括三环类抗抑郁药、单胺氧化酶抑制剂、选择性五羟色胺/去甲上腺素再摄取抑制剂）还是对接近三分之一病人的治疗效果不理想，即使有治疗效果也需规律用药数周才能产生。因此，人们需要更深入理解抑郁症的病理生理机制，找到新的治疗方法和策略。已有研究提示中脑腹侧被盖区（VTA）区多巴胺（DA）系统在抑郁症的发病机制中起了关键作用，并可能作为新的治疗靶点。VTA区DA能神经元具有自发放电特性，并存在规律性和簇发性（burst）放电模式。其中burst高频放电可以显著调节DA水平并影响动物行为，而规律性低频放电则无此作用。近年已经有研究发现VTA区DA神经元的burst放电能够直接控制啮齿类动物模型的抑郁样行为。
　　VTA区DA能神经元兴奋模式可被众多膜受体和离子通道影响（如NMDA受体、GABAA受体、钙激活钾通道、L-型钙通道、超极化激活阳离子通道、G蛋白调控的内向整流钾通道等）。它们都可以调节DA能神经元的兴奋性，但对VTA区DA能神经元兴奋方式的影响和控制原理目前还不是非常清楚。调节VTA区DA能神经元细胞膜上的钾通道影响其兴奋性是其中一种可能存在的方式。例如有研究就发现敲除 VTA区TREK1钾通道可以抑制抑郁样行为的出现；选择性阻断TREK1通道也可以产生快速抗抑郁作用；VTA区 DA神经元钾通道表达的改变与社交挫败模型小鼠的抑郁行为也有明显相关性。
　　Kv7/KCNQ通道是一种电压门控通道，其开放可以导致细胞超极化，稳定细胞膜并抑制细胞兴奋性。Kv7通道包括 Kv7.1-7.5等五种，其中Kv7.2-7.5主要在中枢神经系统表达。已有研究提示Kv7通道可以作为癫痫、焦虑、疼痛、药物成瘾的疾病药物作用靶点。另外也有研究发现Kv7通道在 DA能神经元上有表达并能调节其兴奋性。另外也有研究发现Kv7.4特异性表达在VTA区DA能神经元上，但其潜在功能还不清楚。我们的研究发现Kv7.4能够显著调节VTA区DA能神经元兴奋性，并改善社交挫败模型小鼠的抑郁样行为。同时，由于Kv7.4通道在中枢神经系统表达部位的特异性远远高于其他Kv7亚基，所以Kv7.4可以作为一个新的治疗靶点，并且其副作用会远远小于其他治疗靶点。
　　第一部分调节Kv7.4通道对VTA区DA能神经元兴奋性的影响
　　目的：观察Kv7通道开放对在体记录VTA区DA能神经元兴奋性的影响。
　　方法：建立在体单单位（single unit）电生理记录小鼠VTA DA能神经元放电的方法，确定其电生理学特性；腹腔注射Kv7开放剂（fasudil和RTG）观察其对VTA区DA能神经元放电的影响。
　　结果：在此前的研究中，我们利用膜片钳全细胞记录和细胞贴附模式记录野生型小鼠VTA区DA能神经元的自发放电，给予fasudil（10?M）可以降低其放电频率，而在Kv7.4敲除小鼠则没有作用，说明fasudl可以选择性激活Kv7.4。但是利用这两种方法无法记录DA能神经元的在体生理放电模式。而只有在在体单电位记录时，DA能神经元存在规律型（tonic）和簇发型（burst）两种放电模式，而后者是影响DA释放及行为学的关键因素。因此，在这部分研究中我们首先建立了在体记录DA能神经元放电的方法。小鼠中脑 VTA由脑立体定位仪确定。DA能神经元放电通过以下特征被确定：典型三向动作电位（AP）并有特征性的负向偏移； AP持续时间≥2 ms； AP从开始到超极化的时间＞1.1 ms；放电峰频率＜10 Hz，偶尔出现burst放电。其中burst放电的起始及终止定义：连续两个AP间隔≤80 ms作为burst放电开始；两个连续AP间隔≥160 ms作为结束。当一个DA能神经元记录放电1 min内出现burst放电即可被认为是burst放电神经元。在野生型小鼠，腹腔注射Kv7.4选择性开放剂fasudil（20 mg/Kg）和Kv7非选择性开放剂retigabine（RTG）均降低了DA能神经元的放电频率，尤其是降低了burst细胞的放电频率和burst放电峰百分比（burst放电峰数/总放电峰数×100%）。而在Kv7.4敲除小鼠，fasudil对DA能神经元的放电没有影响，而RTG仍降低DA能神经元的放电。
　　结论：建立了在体记录VTA区DA能神经元放电的方法，并确定了其电生理特性；调节Kv7通道（fasudil和RTG）能够降低VTA区DA能神经元兴奋性，特别是burst放电，其中fasudilt通过选择性激活Kv7.4降低DA神经元兴奋性。
　　第二部分 Kv7.4在社交挫败模型小鼠VTA区DA能神经元兴奋性和抑郁样行为变化中的作用
　　目的：观察Kv7.4在社交挫败模型小鼠VTA区DA能神经元兴奋性改变中的作用
　　方法：建立社交挫败小鼠模型并明确其抑郁样行为的标准；利用在体电生理记录方法观察模型小鼠VTA区DA能神经元兴奋性的改变；利用qPCR和western blot技术观察抑郁模型小鼠VTA DA Kv7.4通道表达与神经元兴奋性的关系。
　　结果：我们的研究发现社交挫败模型小鼠的抑郁样行为与VTA区DA能神经元兴奋性增高有直接关系，这与此前的研究相似。我们进一步研究了Kv7.4通道与社交挫败模型小鼠VTA区DA能神经元兴奋性增高的关系。首先，我们利用糖水偏爱实验、社交时间两个指标确定社交挫败模型是否建立成功。社交挫败敏感小鼠表现为糖水偏爱降低和社交时间减少，而没有表现出糖水偏爱降低和社交时间减少的小鼠确定为社交挫败非敏感小鼠。与此前报道相似，敏感小鼠VTA区DA能神经元放电频率明显增高，而且与DA能神经元生理功能关系更为密切的burst放电也明显增多，而正常和非敏感小鼠没有变化。另外为观察Kv7.4通道是否与敏感小鼠DA能神经元异常兴奋有关，我们测定了Kv7.4基因的表达量，发现敏感小鼠Kv7.4基因表达明显减少，并且Kv7.4表达量的多少与DA能神经元放电频率呈明显负相关。与基因表达相似，敏感小鼠VTA区Kv7.4蛋白表达量也明显降低。
　　结论：社交挫败敏感小鼠VTA区DA能神经元兴奋性明显增高，burst放电明显增加； VTA区DA能神经元兴奋性与Kv7.4通道表达存在明显负相关性。
　　第三部分调节Kv7.4功能对社交挫败小鼠VTA区DA能神经元兴奋性及抑郁样行为的作用
　　目的：观察调节Kv7.4功能对社交挫败小鼠VTA区DA能神经元兴奋性及抑郁样行为的影响
　　方法：利用在体电生理记录方式观察fasudil和RTG对社交挫败敏感小鼠VTA区DA能神经元放电频率及burst放电的影响；利用社交箱观察fasudil和RTG对社挫败敏感小鼠社交时间的影响。
　　结果：利用在体单单位（single unit）记录模式，我们发现fasudil和RTG均可降低野生社交挫败敏感小鼠VTA区DA能神经元的放电频率，特别是burst放电（burst放电数百分比、单个burst放电数）也明显减少。但是在Kv7.4敲除小鼠，fasudil却没有影响社交挫败敏感小鼠DA能神经元放电，但是RTG对DA能神经元放电的仍有较小的影响。更重要的是在野生型社交挫败敏感小鼠腹腔注射fasudil和RTG后，其社交时间明显增加；与对神经元放电的影响相同，在Kv7.4敲除小鼠，fasudil没有影响社交挫败敏感小鼠社交时间，而RTG则仍然有作用。需要提出的是RTG在影响小鼠社交行为的同时也对动物自发活动有影响；通过开放旷场实验发现，腹腔注射RTG后不论野生型还是Kv7.4敲除小鼠，不论对照组还是社交挫败敏感小鼠，其移动速度均明显减小，而 fasudil对动物自发活动则没有明显影响。
　　结论：开放Kv7.4通道可明显降低社交挫败敏感小鼠VTA区DA能神经元的兴奋兴特别是burst放电，并改善其抑郁样行为。

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引言

第一部分调节Kv7.4通道对VTA区DA能神经元兴奋性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分社交挫败模型小鼠抑郁样行为及VTA区DA能神经元兴奋性变化

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分调节Kv7通道对社交挫败模型小鼠VTA区DA能神经元兴奋性及抑郁样行为的作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述: 多巴胺能神经元兴奋性及其影响因素

致谢

个人简历