PINK1介导的线粒体自噬障碍在NASH发病机制中的作用

摘要

目的：
　　非酒精性脂肪性肝病（Nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD）是全球最常见的慢性肝脏疾病之一，可分为单纯性脂肪肝（Nonalcoholic simple fatty liver, NAFL）、非酒精性脂肪性肝炎（Nonalcoholic steatohepatitis, NASH）及肝硬化，其中NASH是NAFLD疾病进程中的关键环节，但 NASH的发病机制尚不明确。最新研究证实，线粒体功能障碍，可诱导NLRP3炎症小体活化，加重炎症反应，而PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是清除受损线粒体的经典途径之一。本研究旨在通过检测PINK1-Parkin介导的线粒体自噬水平，探讨线粒体自噬对NASH病情演变过程中NLRP3依赖性炎症反应的影响。
　　方法：
　　采用胆碱蛋氨酸缺乏(Methionine-choline deficient diet, MCD）饮食构建小鼠 NASH模型，其对照组喂食胆碱蛋氨酸含量充足（Methionine-Choline sufficient diet, MCS）的饲料。检测小鼠血清丙氨酸氨基转移酶（Alanine transaminase, ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（Aspartate transam inase, AST）、总超氧化物歧化酶（Total-superoxide dismutase, T-SOD）、丙二醛（Methane dicarboxylic aldehyde, MDA）、过氧化氢（H2O2）水平；部分肝组织石蜡包埋后切片，用于苏木素-伊红（Hematoxylin-eosin, HE）染色、Masson染色、油红O染色观察肝脏病理变化；余肝组织经液氮速冻后，-80℃冰箱保存，用于实时荧光定量PCR（Quantitative Real-time PCR, RT-qPCR）检测肝组织PINK1、Parkin、NLRP3、caspase1、ASC、IL1β、IL18 mRNA表达，Western blot检测肝组织LC3Ⅱ、P62、PINK1、Parkin、NLRP3的表达。
　　结果：
　　1成功构建小鼠NASH模型
　　实验结果可见0周组小鼠体毛整齐有光泽，体重正常，活动度正常，精神良好，进食正常；MCS4周组及MCS8周组小鼠体毛整齐有光泽，体重增加，活动正常，精神良好，进食正常；MCD4周组小鼠体毛凌乱、无光泽，体重减轻，活动减弱，精神欠佳，进食减少；MCD8周组小鼠的体毛凌乱、无光泽，体重明显减轻，活动减弱，精神萎靡，进食量明显下降。
　　小鼠体质量、肝指数比较：与0周组及MCS对照组相比，MCD模型组小鼠的体重均明显降低（P<0.01），但MCD8周组体重与MCD4周组相比差异无统计学意义；MCD8周组小鼠肝指数较0周组、MCD4周组及MCS8周组升高（P<0.05），差异有统计学意义。
　　2小鼠血清生化指标
　　与0周组及MCS对照组相比，MCD模型组小鼠血清ALT、AST水平均明显升高（P<0.01），且MCD8周组ALT、AST水平较MCD4周组升高（P<0.05），差异具有统计学意义。
　　3肝脏大体标本的观察
　　0周组及 MCS4周组小鼠肝脏呈深红色,有光泽,质软,边缘锐利,密度正常；MCD4周组小鼠肝脏体积增大、呈淡黄色、可见组织间充盈淡黄色脂肪斑点、边缘变钝；MCS8周组小鼠肝脏呈淡红色、有光泽、偶见组织间有淡黄色脂肪斑点、边缘锐利；MCD8周组小鼠肝脏体积增大、呈黄色、可见黄色脂肪斑，密度降低、边缘钝。
　　4肝组织病理学改变
　　HE染色结果显示：0周组及MCS4周组：肝小叶结构清晰，以中央静脉为中心，肝细胞索呈放射状排列，肝细胞结构完整，大小均匀，无变性、坏死及炎细胞浸润；MCD4周组：大量肝细胞内存在脂肪空泡，部分区域出现肝索结构紊乱，可见炎细胞浸润；MCS8周组：偶见散在的脂质沉积和脂肪变，但无大泡样改变及炎细胞浸润；MCD8周组：肝细胞内充满大量大小不一的脂肪空泡，肝细胞结构紊乱呈气球样变，大量炎细胞浸润，呈灶状分布，以单核细胞、淋巴细胞为主。
　　Masson染色结果显示：0周组及MCS4周组：肝小叶结构完整，除汇管区内有胶原纤维染色外，未见有胶原纤维；MCD4周组：肝小叶结构尚存，纤维局限于汇管区，细胞呈长梭形，窦周隙内少量胶原纤维增生；MCS8周组：肝小叶结构完整，汇管区及窦周隙可见少量胶原纤维增生；MCD8周组：肝小叶结构紊乱，小叶中央有胶原纤维存在，可见明显的肝细胞坏死及纤维组织增生，增生的胶原纤维分布于窦周隙内。
　　油红O染色结果显示：0周组及MCS4周组小鼠肝组织未见红色脂滴；MCD4周组小鼠肝组织可见大量红色脂滴，肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为40~65％；MCS8周组可见少量散在红色脂滴，成小颗粒状，肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为3~10%；MCD8周组小鼠肝组织可见大量红色脂滴，部分融合成片，肝小叶内含脂滴细胞数/总细胞数约为65～90%。
　　肝组织病理NAS评分：MCD4周组及MCD8周组肝组织评分较0周组、MCS对照组显著升高（P<0.05），总分>5分，符合 NASH组织学诊断。
　　5小鼠血清SOD、MDA、H2O2水平
　　与0周组及 MCS对照组相比，MCD模型组小鼠血清 MDA、H2O2水平均升高，SOD水平降低（P<0.05）；且MCD8周组H2O2水平较MCD4周组升高，而SOD水平较MCD4周组降低（P均<0.05）。
　　6肝组织PINK1、Parkin、NLRP3、caspase1、ASC、IL1β、IL18mRNA的表达
　　RT-qPCR结果显示：与0周组及MCS对照组相比，MCD模型组小鼠肝组织NLRP3、caspase1、ASC、IL1β、IL18 mRNA表达水平均明显升高， Parkin mRNA表达水平降低，且MCD8周组与MCD4周组相比差异有统计学意义（P<0.05）；MCD8周组小鼠肝组织PINK1 mRNA表达较0周组、MCD4周组及MCS8周组均明显升高（P均<0.05）。
　　7肝组织LC3Ⅱ、P62、PINK1、Parkin、NLRP3蛋白的表达
　　Western blot结果显示：与0周组及MCS对照组相比，MCD模型组小鼠肝组织 PINK1、Parkin蛋白表达均降低、NLRP3蛋白表达升高，且MCD8周组与MCD4周组相比差异有统计学意义（P均<0.05）；LC3Ⅱ蛋白表达在MCD4周组较0周组、MCS4周组升高，而在MCD8周组降低（P均<0.05）；P62蛋白表达在MCD8周组较0周组、MCD4周组及MCS8周组均明显升高（P均<0.05），差异具有统计学意义。
　　8 NASH小鼠肝组织PINK1与NLRP3相关性分析
　　NASH小鼠肝组织PINK1与NLRP3呈负相关，相关系数为r=-0.821（P<0.01）。
　　结论：
　　1 PINK1-Parkin介导的线粒体自噬参与了NASH的病理过程。
　　2线粒体自噬功能障碍，可能通过上调ROS，激活NLRP3炎症小体，促进NASH疾病进展。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1 仪器设备

2 主要试剂

3 主要溶液的配制

4 实验方法

5 统计学处理

结果

3 肝脏大体标本的观察

4 肝组织病理学改变

5 小鼠血清SOD、MDA、H2O2水平

6 肝组织PINK1、Parkin、NLRP3、caspase1、ASC、IL1β、IL18mRNA的表达

7 肝组织LC3Ⅱ、P62、PINK1、Parkin、NLRP3蛋白的表达

8 NASH小鼠肝组织PINK1与NLRP3相关性分析

附图

附表

讨论

结论

参考文献

综述:细胞自噬与非酒精性脂肪性肝病

致谢

个人简历