少突胶质细胞和星形胶质细胞中的FGF9可能与ALS小鼠的疾病进展密切相关

摘要

目的：
　　肌萎缩侧索硬化（amyotrophic lateral sclerosis，ALS）是一种可以引起脑和脊髓中运动神经元死亡的神经系统疾病,该病可以影响随意肌并且逐渐导致整个身体的瘫痪。大多数ALS病人都是散发性的，大约5-10％是家族性的。ALS由多种因素引起，包括某些特定基因的突变，其中最多被影响的是超氧化物歧化酶基因（super oxide dismutase， SOD），突变的SOD1基因可以同时是获得和丢失功能的突变。有毒的突变已被证明可以改变SOD1的活性，导致高毒性的羟自由基积累。突变的SOD1蛋白不仅聚集在神经元中，还在运动神经元周围的胶质细胞中聚集。ALS是一个非细胞自主性的神经系统疾病，疾病的进展特征除了运动神经元内的持续损伤外，也以星形胶质细胞激活为特征。小胶质细胞和星形胶质细胞中错误折叠的SOD1突变蛋白以及应对神经元损伤后的反应性激活，可以引起炎症反应进而导致毒性因子释放增加。此外，有研究表明神经分泌囊泡和神经内分泌系统的蛋白质成分嗜铬颗粒蛋白可以和突变的SOD1蛋白相互作用。嗜铬颗粒蛋白有可能作为伴侣样的蛋白协助运动神经元和星形胶质细胞的突变SOD1蛋白的分泌。这个细胞外的突变SOD1蛋白可以引起小胶质细胞增生，最终引起神经元的死亡。成纤维生长因子9（fibroblast growth factor9，FGF9）在中枢神经系统内主要表达在神经元，作为胶质细胞激活因子（Glia-activating factor，GAF）以自分泌或旁分泌的方式来促进神经元和胶质细胞的分化和存活，有证据证明FGF9与阿尔茨海默病（Alzheimer's disease， AD）、帕金森病（Parkinson's disease， PD）、重度抑郁症（major depressive disorder，MDD）等密切相关，但其在运动神经元病中作用还没有被研究，我们之前的研究发现，在终末期SOD1突变阳性和阴性的小鼠的基因芯片中FGF9的表达大量减少，RT-PCR结果表明在FGF9在mRNA水平上表达也大量减少，因此，我们的目的是观察FGF9在SOD1G93A小鼠终末期有怎样的变化，评估其是否对SOD1转基因小鼠的疾病进展起着关键作用，有助于探究ALS疾病机制，也为ALS的有效治疗提供新的可能。
　　方法：
　　首先提取鼠尾DNA筛选出SOD1G93A转基因小鼠和同窝对照小鼠（littermate），选择终末期SOD1G93A小鼠为实验组,littermate为对照组，用不同的标记物对其腰髓进行免疫荧光染色，观察两组小鼠脊髓前角神经元丢失和胶质细胞增生的情况；再提取它们的腰髓蛋白进行蛋白印迹实验，测量FGF9、胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和髓鞘相关糖蛋白（MAG）
　　的蛋白表达；最后同时染色 FGF9和 NeuN,FGF9和 Iba-1,FGF9和 GFAP,FGF9和 NG2， FGF9和 CC1， FGF9和 MBP评估FGF9在终末期SOD1G93A转基因小鼠和littermate腰髓前角中的表达情况。
　　结果：
　　1子代鼠基因组DNA经PCR扩增，电泳后应用GBOX-HR全自动凝胶成像系统观察电泳结果：位于200-300bp之间的条带（236bp）为mSOD1的扩增产物，此小鼠为SOD1G93A转基因的小鼠。没有此条带的为非 SOD1G93A转基因小鼠。
　　2我们用免疫荧光技术测定了终末期SOD1G93A转基因小鼠和它的同窝对照鼠的腰髓前角中神经元数量和胶质细胞增生情况。在终末期，与littermate相比， SOD1G93A鼠腰髓前角中NeuN染色阳性的细胞数显著减少（P<0.001），GFAP染色阳性的细胞数显著增加（P<0.001），且细胞突起增多，染色增强，提示星形胶质细胞在SOD1G93A终末小鼠中成激活状态，Iba-1染色阳性的细胞数显著增加（P<0.001），NG2阳性的细胞数显著增加（P<0.001），且结构紊乱、边界不清，CC1阳性的细胞数显著增加(P<0.001)，细胞形状不规则、边界模糊、欠圆润且有突起，而littermate组CC1阳性的细胞圆形、边界清晰且无突起。littermate鼠中MBP染色阳性的髓鞘边缘平滑，染色均一，而SOD1G93A鼠MBP阳性的髓鞘结构紊乱，呈串珠样，粗细不等，染色深浅不一，髓鞘间边界不清，欠平滑，提示终末期SOD1阳性鼠有脱髓鞘发生。
　　3在蛋白水平上检测了终末期SOD1G93A和littermate小鼠中腰髓中的FGF9的表达，结果发现，与 littermate相比， SOD1G93A小鼠FGF9蛋白显著减少（P<0.001），GFAP显著增多（P<0.01），MAG表达量无统计学差异（P>0.1）。
　　4我们在终末期SOD1G93A小鼠和littermate的腰髓前角中染色了FGF9，运用激光共聚焦技术观察到在终末期，与 littermate相比， SOD1G93A小鼠FGF9阳性的细胞数减少但无统计学差异（P>0.1），但形状和大小出现异常，对照组被FGF9染色的细胞大且饱满，有少量突起，而突变组被FGF9染色的细胞小且细长，突起较多，呈星形状。
　　针对这个现象，我们分别同时标记FGF9和NeuN， FGF9和GFAP， FGF9和Iba-1，FGF9和NG2，FGF9和CC1，FGF9和MBP。结果发现，littermate中FGF9主要存在于神经元中，而在星形胶质细胞、小胶质细胞、少突细胞的前体细胞、成熟的少突胶质细胞胞体和髓鞘中几乎看不到FGF9的表达。但在终末期SOD1G93A小鼠中由于神经元的大量丢失，FGF9也大量减少，仅残存少数与NeuN共定位的FGF9阳性细胞。此外，尚存在大量未与NeuN共定位的FGF9阳性细胞。于是我们在终末SOD1阳性小鼠脊髓中同时染色FGF9和GFAP，FGF9和Iba-1，发现FGF9与GFAP共定位,说明终末期SOD1G93A鼠的星形胶质细胞中的FGF9被激活表达；FGF9并未与Iba-1共定位,说明FGF9并不在终末期SOD1G93A鼠的小胶质细胞中表达；分别染色FGF9和NG2， FGF9和CC1， FGF9和MBP，发现FGF9未在少突胶质细胞前体和成熟少突胶质细胞的髓鞘中表达，却在成熟少突胶质细胞胞体中大量表达。
　　结论：
　　1我们的结果表明，与同窝非转基因小鼠相比，终末期SOD1G93A小鼠脊髓中的神经元大量丢失，小胶质细胞、星形胶质细胞和少突细胞数量显著增加，表明终末期SOD1G93A鼠脊髓胶质细胞增生明显，并且观察到星形胶质细胞和少突胶质细胞结构也发生了改变，提示这两种细胞处于激活状态。
　　2我们还发现虽然位于神经元中的FGF9随神经元丢失而减少，但是位于少突胶质细胞和星形胶质细胞中的FGF9在终末阶段大量表达，推测FGF9可能与少突胶质细胞和星形胶质细胞的激活状态有关，从而与疾病进展密切相关，胶质细胞中FGF9的大量异常表达有可能加重运动神经元的死亡。关于ALS中少突胶质细胞的研究并不多，我们的实验在胶质细胞增生部分研究了少突胶质细胞的形态及数量的变化，为研究ALS的病因和治疗靶点提供了新的可能。此外，目前尚未有研究将ALS与FGF9联系起来，我们的研究证明了FGF9在正常对照鼠和终末期SOD1G93A鼠之间表达位置和数量发生了显著改变，提示FGF9有可能是ALS疾病发展中的关键因子。

目录

声明

英文缩写

前言

材料与方法

1材料

实验方法

3统计学处理

结果

附图

讨论

结论

参考文献

综述:FGF9在中枢神经系统的研究进展

致谢

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