Caveolin-1对EGFR突变阳性肺腺癌EGFR-TKIs敏感性的影响

摘要

肺癌是世界范围内发病率和死亡率一直位居首位的恶性肿瘤。非小细胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）占所有肺癌总数的85％左右，而肺腺癌是其中最常见的病理类型。尽管肺癌的早期检测有了巨大的提升，但大部分患者被确诊时已属于肺癌晚期，从而导致预后不良。
　　表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor， EGFR）在40%-80%的NSCLC中呈现过表达，其同源或异源二聚体化和自身磷酸化都会激活下游的MAPK和PI3K信号通路，从而引起细胞过度生长，生存和转移。以EGFR为靶点的酪氨酸激酶抑制剂（tyrosin kinase inhibitors， TKIs）可通过与ATP竞争性结合EGFR酪氨酸激酶域从而抑制肿瘤细胞的生长。因此，EGFR-TKIs已成为EGFR突变阳性的肺腺癌治疗的有效手段。且有研究证实肿瘤细胞中EGFR-TKIs的敏感性和EGFR基因的突变类型相关，其敏感突变为19外显子缺失突变（delE746-A750）、18外显子点突变（L858R）和21外显子点突变（G719S）。因此，EGFR-TKIs已成为EGFR敏感突变型晚期NSCLC患者的一线用药方案。然而， EGFR-TKIs疗效存在明显的个体差异，约25%带有EGFR敏感突变类型的患者对EGFR-TKIs不敏感或治疗无反应，即发生原发耐药。而且即使对EGFR-TKIs治疗起初有效的患者，其临床疗效也不尽一致，且最终都不可避免的出现获得性耐药。虽然针对EGFR突变本身（T790M）、EGFR通路相关分子（c-MET扩增）以及其他通路分子的研究已部分证实均和EGFR-TKIs耐药有关，但尚不足解释EGFR-TKIs在EGFR基因突变肺腺癌患者中的疗效差异。
　　小凹蛋白（Caveolin-1，Cav-1）是细胞质膜表面特异性膜内陷囊泡的重要标志性结构蛋白，分子量21-24kDa。Cav-1可以通过其微囊中的脚手架结合域和许多信号蛋白结合（EGFR、ErbB2、H-Ras、MEK等）从而影响和调控其下游的信号转导通路进而导致细胞一系列生物学行为的改变。许多研究证实Cav-1在肿瘤的发生发展中起着非常重要的作用。我们的前期实验也已证实，在肺腺癌细胞中，Cav-1通过影响EGFR的磷酸化调节其下游信号转导，从而影响肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等能力。另外，有研究显示Cav-1与肿瘤细胞的多药耐药和对化疗药的敏感性有关，且在许多耐药的肿瘤细胞中Cav-1呈现高表达。但目前为止关于Cav-1是否影响分子靶向药的敏感性尚未见报道。
　　本研究通过临床结合细胞学体内外实验研究以期明确（1）Cav-1表达量是否与肺腺癌对EGFR-TKIs的敏感性有关。（2）Cav-1影响肺腺癌EGFR-TKIs敏感性的分子机制。为临床解释EGFR-TKIs疗效的个体差异提供可能的理论依据，为临床精准选择EGFR-TKIs药物提供新的生物标记物，为临床研发克服EGFR-TKIs耐药的新药提供新靶点。
　　第一部分：Caveolin-1在EGFR突变阳性晚期肺腺癌组织中的表达及其与吉非替尼疗效的相关性研究
　　目的：明确Cav-1在EGFR突变阳性晚期肺腺癌组织中的表达以及探讨其与吉非替尼疗效的相关性。
　　方法：
　　1.临床标本
　　选取中国人民解放军白求恩国际和平医院2011年7月-2014年7月收治的接受吉非替尼一线治疗的EGFR突变阳性（19外显子缺失突变）的晚期（IIIB或IV期）肺腺癌患者标本20例。近期疗效评判标准按照实体肿瘤疗效评价标准（Response Evaluation Criteria in Solid Tumors, RECIST1.1），分为完全缓解（Complete Response, CR）、部分缓解（Partial Response, PR）、疾病稳定（Stable Disease, SD）和疾病进展（Progressive Disease, PD）。远期疗效为无疾病进展时间（Progression Free Survival, PFS）和总生存期（Overall Survival, OS）。
　　2.免疫组化
　　将福尔马林固定、石蜡包埋的蜡块制成5μm的连续切片，孵育Cav-1和Ki-67抗体后进行免疫染色。免疫组化的结果由两位有经验的病理科大夫利用双盲法进行评分。采用H指数分析Cav-1表达情况可综合考虑染色强度和密度，其中染色强度分为0-3四个等级；染色密度有低至高分别记为0-100。最终H指数由以下公式计算得出：H指数=(染色强度为1细胞面积%×1)+(染色强度为2细胞面积%×2)+(染色强度为3细胞面积%×3)。Ki-67阳性信号为细胞核内出现棕黄色细小颗粒，计数500个肿瘤细胞中阳性细胞所占百分比来计算平均阳性率。
　　结果：
　　1.Cav-1在肺腺癌组织中的表达
　　光镜下观察Cav-1染色情况，可见其分布于细胞膜和细胞浆，而Ki-67分布于细胞核。通过H评分和线性相关分析，发现在肺腺癌组织中，Cav-1表达与Ki-67表达呈正相关（r=0.71;P<0.05）。
　　2.高表达Cav-1预示吉非替尼疗效不佳及PFS较短
　　根据患者的病理特征分组分析发现，这些病理特征与Cav-1的表达水平并无统计学差异（P>0.05），但根据吉非替尼治疗的疾病反应率、PFS和OS分组的分析发现，其与Cav-1的表达水平均具有统计学差异（P<0.05）。经吉非替尼治疗后，所有患者的总缓解率达60%，且（CR+PR）组的病人中Cav-1的评分明显低于（SD+PD）组。此外，所有患者的中位PFS为8个月（95%CI:6.910-9.090），且患者PFS较短的分组中Cav-1的评分明显高于PFS较长组；所有患者的中位OS为16.5个月（95%CI:13.578-19.422），且患者OS较短的分组中Cav-1的评分明显高于OS较长组。以所有患者组织标本中Cav-1评分的中位数为截断值，将患者分为Cav-1高表达组和低表达组。通过分析发现，Cav-1高表达组中患者的总缓解率明显低于Cav-1低表达组，差异具有统计学意义（P<0.05）；Cav-1高表达组中患者的PFS明显短于Cav-1低表达组，差异具有统计学意义（P<0.05）；而两组间的OS并无统计学差异（P>0.05）。
　　第二部分：敲低 Caveolin-1的表达对 EGFR突变阳性肺腺癌细胞EGFR-TKIs敏感性的影响
　　目的：探讨敲低Cav-1的表达对EGFR突变阳性肺腺癌细胞EGFR-TKIs敏感性的影响。
　　方法：
　　1.细胞转染
　　选取对EGFR-TKIs敏感的中量表达Cav-1的PC-9细胞，分别转染Control shRNA或Cav-1 shRNA质粒，嘌呤霉素进行抗性筛选，构建正常表达Cav-1的PC-9/Ctrl和低表达Cav-1的PC-9/KD细胞。
　　2.增殖抑制实验
　　将细胞接种于96孔板，过夜贴壁后分别用不同浓度的EGFR-TKIs（吉非替尼和厄洛替尼）处理，培养一定的时间后上机检测吸光度值（OD）。半数抑制浓度（half maximal inhibitory concentration, IC50）定义为细胞抑制达50%时的药物浓度。而后，以每对转染细胞中较低的IC50来处理细胞，检测不同时间点（24h、48h、72h）的细胞抑制率。
　　3.克隆形成实验
　　克隆形成实验是以一种细胞不相互接触的方式来检测细胞增殖快慢的实验。细胞以低密度接种，300个/培养皿，在有或无EGFR-TKIs的环境中培养，8-12天后可观察到肉眼可见的克隆，苏木素染色后进行计数。
　　4.划痕实验
　　将细胞接种于24孔板，过夜贴壁后形成单细胞层，移液器枪头进行划痕，在有或无EGFR-TKIs的环境中培养，不同时间点进行拍照直到划痕愈合。
　　5.侵袭实验
　　将稀释后的基质胶铺于小室的上室，当胶凝固后加入有或无EGFR-TKIs处理的细胞，下室加入适量完全1640培养基。培养24h后，将穿膜的细胞进行HE染色，显微镜下拍照和计数。
　　6.蛋白印迹
　　将有或无EGFR-TKIs处理的细胞裂解和定量后，10%SDS-PAGE分离蛋白、转膜、5%脱脂奶粉或3%牛血清白蛋白封闭、一抗4℃过夜孵育、二抗常温孵育1h，最后ECL试剂盒进行显色。
　　7.免疫共沉淀
　　将裂解后的细胞蛋白分别用抗EGFR和抗Cav-1的抗体进行免疫沉淀，4℃过夜孵育。然后在每管样品中加入40?l蛋白G琼脂糖微珠，4℃滚动混匀2h。蛋白印迹分别检测蛋白裂解液和免疫沉淀复合物中EGFR和Cav-1蛋白的表达。
　　8.激光共聚焦
　　将细胞接种到提前置入盖玻片的培养皿中，4%多聚甲醛固定20min，0.1%TritonX-100透化10min，8%BSA封闭1h，抗Cav-1和抗EGFR抗体同时加到载玻片上4℃过夜孵育，荧光二抗Alexa Flour488羊抗鼠 IgG和Alexa Flour555羊抗兔IgG同时加到载玻片上37℃避光孵育1h。DAPI染核室温避光孵育5min。激光共聚焦显微镜下观察细胞染色情况并拍照9体内实验
　　5周龄裸鼠右背部皮下接种细胞，每周测量瘤径,计算肿瘤体积：瘤体积=1/2×长径×短径2。当瘤体积达40mm3时，将各组裸鼠分别分为加药组（吉非替尼6mg/kg）和不加药组（相同体积的灭菌水）。灌胃4周后脱颈处死裸鼠，称量瘤重并计算抑瘤率。每只裸鼠的瘤组织用于后续蛋白印迹和免疫组织化学
　　结果：
　　1.稳定转染细胞株的构建
　　PC-9/KD细胞中Cav-1的相对表达量明显低于PC-9亲本株和PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。结果证实：敲低Cav-1表达的稳定转染细胞株构建成功。
　　2.敲低Cav-1的表达增强PC-9细胞对EGFR-TKIs的敏感性
　　MTS法检测Cav-1表达对PC-9细胞EGFR-TKIs敏感性的影响，结果显示：在不同浓度EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼， PC-9/KD细胞的生长抑制率明显高于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05），且随浓度的递增，细胞的生长抑制率也增加。PC-9/KD细胞的IC50值明显低于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。在不同时间点（24h、48h、72h）作用下，PC-9/KD细胞的生长抑制率同样明显高于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05），且随着时间点的延长，细胞的生长抑制率也增加。结果证实：EGFR-TKIs对PC-9的抑制作用具有时效性和量效性；敲低Cav-1表达增强PC-9细胞对EGFR-TKIs的敏感性。
　　3.敲低Cav-1的表达抑制PC-9细胞的增殖、迁移和侵袭，增强EGFR-TKIs对细胞生物学行为的抑制效应
　　无EGFR-TKIs作用时，PC-9/KD细胞的克隆形成率明显低于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼，EGFR-TKIs对PC-9/KD细胞克隆形成的抑制效应明显强于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。无EGFR-TKIs作用时，PC-9/KD细胞的划痕愈合时间明显长于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼， EGFR-TKIs对PC-9/KD细胞划痕愈合的抑制效应明显强于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。无EGFR-TKIs作用时，PC-9/KD细胞的穿膜数明显少于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼，EGFR-TKIs对PC-9/KD细胞侵袭能力的抑制效应明显强于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。结果证实：敲低Cav-1表达抑制PC-9细胞的增殖、迁移和侵袭，增强EGFR-TKIs对其抑制的效应。
　　4.敲低Cav-1的表达通过抑制EGFR的活化增强PC-9细胞对EGFR-TKIs的敏感性
　　无EGFR-TKIs作用时，PC-9/KD细胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk的相对水平明显低于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。在有EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼，EGFR-TKIs对PC-9/KD细胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk表达水平的抑制效应明显强于PC-9/Ctrl细胞，差异均有显著性（P<0.05）。免疫共沉淀实验证实Cav-1和EGFR可以直接结合。激光共聚焦显微镜下观察到细胞膜和细胞浆处红色区域代表Cav-1表达，绿色区域代表EGFR表达，将两者merge后的黄色代表Cav-1和EGFR共定位。结果证实：敲低Cav-1表达降低PC-9细胞中MAPK和PI3K信号通路活化蛋白的表达，增强EGFR-TKIs敏感性。
　　5.敲低Cav-1的表达抑制裸鼠肿瘤组织的生长
　　PC-9/KD组裸鼠肿瘤体积明显小于PC-9/Ctrl组，差异均有显著性（P<0.05）；PC-9/KD组裸鼠肿瘤重量明显轻于PC-9/Ctrl组，差异均有显著性（P<0.05）。
　　6.敲低Cav-1的表达增强肺腺癌肿瘤组织对吉非替尼的敏感性
　　在吉非替尼灌胃2周后， PC-9/KD组的裸鼠肿瘤体积开始缩小，而PC-9/Ctrl组的裸鼠肿瘤体积呈缓慢增长的趋势，差异均有显著性（P<0.05）。PC-9/KD组的抑瘤率明显大于PC-9/Ctrl组，差异均有显著性（P<0.05）。Western blot实验检测Cav-1表达对瘤组织中MAPK和PI3K信号通路蛋白表达的影响，结果同体外实验一致。免疫组织化学结果显示：PC-9/KD组中Cav-1和Ki-67的表达水平明显低于PC-9/Ctrl组；无吉非替尼作用时，Cav-1的表达水平与Ki-67存在正相关；有吉非替尼作用时，Ki-67的表达水平明显下降。
　　第三部分：过表达Caveolin-1对EGFR突变阳性肺腺癌细胞EGFR-TKIs敏感性的影响
　　目的：探讨过表达Cav-1对EGFR突变阳性肺腺癌细胞EGFR-TKIs敏感性的影响。
　　方法：
　　1.细胞转染
　　选取对EGFR-TKIs敏感的中量表达Cav-1的PC-9细胞，分别转染pcDNA3.1或pcDNA3.1/Cav-1质粒，G418进行抗性筛选，构建正常表达Cav-1的PC-9/pcDNA3.1和过表达Cav-1的PC-9/Cav-1细胞。
　　2.其余方法同第二部分。
　　结果：
　　1.稳定转染细胞株的构建
　　PC-9/Cav-1细胞中Cav-1的相对表达量明显高于PC-9亲本株和PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均有显著性（P<0.05）。结果证实：过表达Cav-1的稳定转染细胞株构建成功。
　　2.过表达Cav-1降低PC-9细胞对EGFR-TKIs的敏感性
　　MTS法检测Cav-1表达对PC-9细胞EGFR-TKIs敏感性的影响，结果显示：在不同浓度EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼， PC-9/Cav-1细胞的生长抑制率明显低于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均有显著性（P<0.05），且随浓度的递增，细胞的生长抑制率也增加。PC-9/Cav-1细胞的IC50值明显高于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均有显著性（P<0.05）。在不同时间点（24h、48h、72h）作用下， PC-9/Cav-1细胞的生长抑制率同样明显低于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均有显著性（P<0.05），且随着时间点的延长，细胞的生长抑制率也增加。结果证实：EGFR-TKIs对PC-9的抑制作用具有时效性和量效性；过表达Cav-1降低PC-9细胞对EGFR-TKIs的敏感性。
　　3.过表达Cav-1促进PC-9细胞的增殖、迁移和侵袭，降低EGFR-TKIs对细胞生物学行为的抑制效应
　　无EGFR-TKIs作用时， PC-9/Cav-1细胞的克隆形成率明显高于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均具有显著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼，EGFR-TKIs对PC-9/Cav-1细胞克隆形成的抑制效应明显弱于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均具有显著性（P<0.05）。无EGFR-TKIs作用时， PC-9/Cav-1细胞的划痕愈合时间明显短于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均具有显著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼，EGFR-TKIs对PC-9/Cav-1细胞划痕愈合的抑制效应明显弱于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均具有显著性（P<0.05）。无EGFR-TKIs作用时，PC-9/Cav-1细胞的穿膜数明显多于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均具有显著性（P<0.05）。在EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼，EGFR-TKIs对PC-9/Cav-1细胞侵袭能力的抑制效应明显弱于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均具有显著性（P<0.05）。结果证实：过表达Cav-1可以增强PC-9细胞的生物学行为，减弱EGFR-TKIs对其抑制的效应。
　　4.过表达Cav-1通过调控EGFR的活化降低PC-9细胞对EGFR-TKIs的敏感性
　　无EGFR-TKIs作用时， PC-9/Cav-1细胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk的相对水平明显高于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均有显著性（P<0.05）。在有EGFR-TKIs作用时，无论吉非替尼还是厄洛替尼， EGFR-TKIs对PC-9/Cav-1细胞中p-EGFR、p-Akt、p-Erk表达水平的抑制效应明显弱于PC-9/pcDNA3.1细胞，差异均有显著性（P<0.05）。免疫共沉淀实验证实Cav-1和EGFR可以直接结合。激光共聚焦显微镜下观察到细胞膜和细胞浆处红色区域代表Cav-1表达，绿色区域代表EGFR表达，将两者merge后的黄色代表Cav-1和EGFR共定位。结果证实：过表达Cav-1促进PC-9细胞中MAPK和PI3K信号通路活化蛋白的表达，减弱EGFR-TKIs敏感性。
　　5.过表达Cav-1促进裸鼠肿瘤组织的生长
　　PC-9/Cav-1组裸鼠肿瘤体积明显大于PC-9/pcDNA3.1组，差异均有显著性（P<0.05）；PC-9/Cav-1组裸鼠肿瘤重量明显重于PC-9/pcDNA3.1组，差异均有显著性（P<0.05）。
　　6.过表达Cav-1降低肺腺癌肿瘤组织对吉非替尼的敏感性
　　在吉非替尼灌胃2周后，PC-9/Cav-1组的裸鼠肿瘤体积呈缓慢增长的趋势，而PC-9/pcDNA3.1组的裸鼠肿瘤体积呈稳定不变或缓慢缩小的趋势，差异均有显著性（P<0.05）。PC-9/Cav-1组的抑瘤率明显小于PC-9/pcDNA3.1组，差异均有显著性（P<0.05）。Western blot实验检测Cav-1表达对瘤组织中MAPK和PI3K信号通路蛋白表达的影响，结果同体外实验一致。免疫组织化学结果显示：PC-9/Cav-1组中Cav-1和Ki-67的表达水平明显高于PC-9/pcDNA3.1组；无吉非替尼作用时，Cav-1的表达水平与Ki-67存在正相关；有吉非替尼作用时，Ki-67的表达水平明显下降。
　　结论：
　　1.Cav-1表达水平与肺腺癌EGFR-TKIs疗效呈负相关；
　　2.敲低Cav-1表达可抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，增加其对EGFR-TKIs的敏感性；
　　3.过表达Cav-1可促进腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭，降低其对EGFR-TKIs的敏感性；
　　4.Cav-1通过调控EGFR的磷酸化水平，激活下游的MAPK和PI3K信号通路，进而促进肺腺癌细胞的生长，降低EGFR-TKIs的敏感性。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分Caveolin-1在EGFR突变阳性晚期肺腺癌组织中的表达及其与吉非替尼疗效的相关性研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分敲低Caveolin-1的表达对EGFR突变阳性肺腺癌细胞EGFR-TKIs敏感性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分过表达Caveolin-1对EGFR突变阳性肺腺癌细胞EGFR-TKIs敏感性的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:非小细胞肺癌EGFR-TKIs耐药机制及治疗策略的研究进展

致谢

个人简历