化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠肾组织整合素α3β1及Wnt/β-catenin通路相关蛋白表达的影响

摘要

第一部分：化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠瘀血阻络相关血尿指标的干预作用
　　目的：建立糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）大鼠模型，通过对大鼠糖脂代谢、蛋白尿排泄、血小板释放及纤溶系统等指标的检测，来观察化瘀通络中药不同配伍的干预作用，为临床疗效的提高及药物的筛查提供依据。
　　方法：75只 SD大鼠适应性喂养1周，随机选10只为正常组（C组）给予普通饲料饲养，余大鼠予高糖高脂饲料喂养联合小剂量链脲佐菌素（streptozocin，STZ）腹腔注射建立 DN模型。成模大鼠随机分为模型组（M组）15只，化瘀通络组（Z组）15只，化瘀组（H组）14只，通络组（T组）14只。大鼠造模成功后即予相应药物灌胃干预，给药量为丹参1.41 g/(kg?d)，川芎1.12 g/(kg?d)，地龙0.94 g/(kg?d)，水蛭0.56 g/(kg?d)，全蝎0.56 g/(kg?d)，Z组大鼠灌服丹参、川芎、地龙、水蛭、全蝎混悬液，H组大鼠灌服丹参、川芎混悬液，T组大鼠灌服地龙、水蛭、全蝎混悬液，C组及 M组大鼠予以相应体积的纯净水灌胃，每日灌胃1次，连续灌胃20周。造模后各时间点（3天、4周、8周、12周、16周、20周）检测大鼠空腹血糖（fasting blood glucose， FBG），20周末检测大鼠糖化血红蛋白（Hemoglobin A1c，Hb A1c）、24h尿蛋白定量（urine total protein，UTP），麻醉大鼠，取血检测血脂， Elisa法检测大鼠血浆β血小板球蛋白（Thromboglobulinβ，β-TG）、血小板因子4（Platelet Factor4， PF4）、纤溶酶原激活物（Tissue type Plasminogen Activator，t-PA）、纤溶酶原激活剂抑制因子1（Plasminogen Activator Inhibitor1，PAI-1）含量。
　　结果：
　　1.大鼠一般情况实验期间 C组大鼠无死亡，20周内 M、T组大鼠死亡3只，Z组大鼠死亡2只，H组大鼠死亡4只，M组1只大鼠血糖缓解，Z、H、T组各2只大鼠血糖缓解，予以剔除。
　　2.不同时间点空腹血糖
　　与同时间点 C组比较，M、Z、H、T组大鼠 FBG明显升高（P＜0.01）；与同时间点M组比较，Z、H、T组大鼠FBG水平无统计学差异（P＞0.05）。
　　3.糖化血红蛋白
　　与 C组比较，M、Z、H、T组大鼠 Hb A1c明显升高（P＜0.01）；与M组比较，Z、H、T组大鼠Hb A1c水平无统计学差异（P＞0.05）。
　　4.24小时尿蛋白定量
　　与 C组比较，M组大鼠24h UTP水平明显升高（P＜0.01）；与 M组比较，Z、H、T组大鼠24h UTP水平明显降低（P＜0.01）；与Z组比较，H、T组大鼠24h UTP水平明显升高（P＜0.05）。
　　5.血脂
　　与 C组比较，M组大鼠胆固醇（total cholesterol，TC）、甘油三酯（triglyceride， TG）、高密度脂蛋白胆固醇（high density lipid cholesterol， HDL-C）、低密度脂蛋白胆固醇（low density lipid cholesterol，LDL-C）和极低密度脂蛋白胆固醇（very low density lipid cholesterol，VLDL-C）水平明显升高（P＜0.01）；与 M组比较，Z、H、T组 TC、HDL-C水平无统计学差异（P＞0.05），TG、LDL-C、VLDL-C水平显著降低（P＜0.05或 P＜0.01）；与 Z组比较，H、T组TC、TG、HDL-C、VLDL-C水平无明显差异（P＞0.05），H组 LDL-C水平明显高于Z组（P＜0.05）。
　　6.血浆β-TG、PF4、t-PA、PAI-1含量
　　与 C组比较，M组大鼠血浆β-TG的含量明显增多（P＜0.05）；与M组比较，Z、T组大鼠血浆中β-TG的含量明显减少（P＜0.05或 P＜0.01）；与 Z组比较，H组大鼠血浆β-TG水平明显升高（P＜0.01），T组大鼠β-TG水平无统计学差异（P＞0.05）。各组大鼠血浆中 PF4的含量无统计学差异（P＞0.05）。
　　与 C组比较，M组大鼠血浆t-PA含量明显减少、PA I-1含量明显增多（P＜0.05）；与M组比较，各干预组t-PA含量明显增多（P＜0.05）， PAI-1含量 Z、T组明显减少（P＜0.05），H组与 M组无统计学差异（P＞0.05）；与Z组比较，H、T组t-PA含量无明显差异（P＞0.05），PAI-1含量H组明显增多（P＜0.05）。
　　第二部分：化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的干预作用
　　目的：验证化瘀通络中药不同配伍是否能够通过改善 DN大鼠脂代谢、血小板释放及纤溶系统相关指标的变化，而产生对 DN肾损伤的保护作用。
　　方法：90只大鼠适应性喂养1周，随机选10只为 C组，造模方法同前。将成模大鼠随机分为M组15只，厄贝沙坦组（I组）14只，Z组15只，H组14只，T组14只。厄贝沙坦组给药量为14.12 mg/(kg?d)，中药干预同前。于注射 STZ后第3天，干预第4、8、12、16、20周末，计量各组大鼠体重、饮水量、饮食量、尿量。干预第20周末，采血检测肝功能、肾功能，称量肾重，留取部分肾皮质用于光镜染色及透射电镜病理观察。
　　结果：
　　1.大鼠一般情况
　　实验期间M、I、T组大鼠各死亡3只，Z组大鼠死亡2只，H组大鼠死亡4只，M组1只大鼠血糖缓解，Z、H、T组各2只大鼠血糖缓解，予以剔除。
　　STZ注射后3天，各组大鼠之间体重无显著差异（P＞0.05）。在干预4周后，与同时间点 C组相比，M组大鼠体重明显降低（P＜0.01）；与同时间点 M组相比，16周后 Z组大鼠体重明显高于M组（P＜0.01），20周末H、T组大鼠体重明显增加（P＜0.05）。
　　与同时间点 C组相比，M组大鼠摄食量明显增多（P＜0.01）；与同时间点 M组比较，各干预组摄食量无统计学差异（P＞0.05）；各干预组之间无显著差异（P＞0.05）。
　　与同时间点 C组相比，M组大鼠饮水量、尿量均明显增多（P＜0.01）；与同时间点 M组比较，Z组在16周后饮水量、尿量显著减少（P＜0.01），而H、T组大鼠在20周末饮水量、尿量明显低于M组（P＜0.05）；与同时间点 I组比较，16周末 Z组饮水量明显低于I组（P＜0.05），20周末Z、H组大鼠饮水量、尿量均明显减少（P＜0.05）。
　　2.肾脏指数（kidney index，KI）
　　与 C组比较，M组 KI显著升高（P＜0.01）；与 M组比较，Z、T组显著降低（P＜0.01或P＜0.05）。
　　3.肝功能、肾功能
　　各组之间比较，血清总蛋白（total protein， TP）、血清白蛋白（albumin，ALB）无明显差异（P＞0.05）。与C组比较，M组大鼠血肌酐（serum creatinine，Scr）、尿素氮（blood urea nitrogen，BUN）、尿酸（uric acid，UA）均明显升高（P＜0.01）；与 M组相比，各干预组 Scr无统计学差异（P＞0.05），Z组BUN显著低于M组（P＜0.05），I、Z、T组 UA明显低于M组（P＜0.01）；与 I组比较，Z组 BUN明显降低（P＜0.01）；H、T组BUN高于Z组（P＜0.05），H组UA高于Z组（P＜0.05）。
　　4.24小时尿蛋白定量
　　STZ注射后3天检测各组24h UTP无显著差异（P＞0.05）。M组大鼠24h UTP均高于同时间点 C组（P＜0.01）；与同时间点 M组比较，各干预组24h UTP均有所降低（P＜0.01或P＜0.05）；与同时间点 I组比较，16周后 Z组大鼠24h UTP明显减少（P＜0.01）；Z组在16、20周末24h UTP均明显低于H组（P＜0.05），Z组仅在20周24h UTP低于T组（P＜0.05）。
　　5.内生肌酐清除率（creatinine clearance rate，Ccr）
　　与 C组比较，M组大鼠 Ccr明显升高（P＜0.01）；与 M组比较，各干预组Ccr均明显下降（P＜0.01或P＜0.05）。
　　6.光镜观察
　　C组大鼠肾脏结构正常；M组大鼠肾小球肥大，囊腔狭窄，部分节段出现球囊黏连，系膜基质增多，基底膜增厚，肾小管细胞肿胀，肾间质出现部分纤维化。与 M组比较，各干预组光镜观察可见不同程度的减轻。计算肾小球体积（GV）并比较，M组大鼠 GV明显增大（P＜0.01）；与 M组比较，各干预组 GV均明显减小（P＜0.01或 P＜0.05）；与I组比较，Z、T组GV显著减小（P＜0.01或P＜0.05）。
　　7.电镜观察
　　C组大鼠超微结构正常；M组可见肾小球基底膜均质增厚，足突融合严重，系膜基质增生。与M组比较，各干预组病理改变减轻，表现为基底膜增厚减轻，足突节段融合。
　　第三部分：化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠肾组织整合素α3β1表达及足细胞密度的影响
　　目的：本部分内容重在研究DN大鼠肾组织中整合素α3β1的表达变化及足细胞密度的关系，及化瘀通络中药不同配伍降低蛋白尿的作用靶点是否与此相关。
　　方法：大鼠造模及分组同前，干预方法同前。干预第20周末，麻醉大鼠，留取部分肾皮质采用 Real-time PCR法及免疫组化法检测ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA及蛋白的表达。采用 WT-1标记足细胞核，计数足细胞数量，计算足细胞密度。
　　结果：
　　1.Real-time PCR检测肾组织ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA表达
　　与 C组相比，M组 ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA的表达明显减少（P＜0.01）；与M组相比，I组、Z组 ITGA3，ITGB1，WT1 mRNA的表达增加（P＜0.01或P＜0.05），T组 ITGA3，WT1 mRNA的表达增加（P＜0.05）；与 I组相比，H组 ITGA3 mRNA表达减少（P＜0.05），Z组 ITGB1 mRNA表达增加（P＜0.05）；与 Z组相比，H组 ITGA3， ITGB1，WT1 mRNA的表达均明显减少（P＜0.05），T组ITGB1 mRNA表达亦减少（P＜0.05）。
　　2.免疫组织化学法检测肾组织ITGA3，ITGB1，WT1蛋白的表达
　　ITGA3，ITGB1主要分布于肾小球基底膜和系膜基质，少量分布于足细胞胞质中，二者在C组大鼠肾小球高表达；与C组相比，ITGA3， ITGB1在 M组大鼠肾小球表达明显减少；与 M组比较，I、Z、T组二者表达增多，H组无明显差异。WT1是足细胞的特异性蛋白，表达在肾小球中且位于足细胞的细胞核内；与 C组相比，M组 WT1表达减少；与M组比较，I、Z、T组WT1表达增多，H组无明显差异。
　　3.各组大鼠肾小球内足细胞密度的检测
　　与C组相比，M组大鼠足细胞密度显著减少（P＜0.01）；与M组相比，I、Z、T组大鼠足细胞密度增加（P＜0.01或 P＜0.05）；与 I组比较，H组密度减少（P＜0.05）；与Z组相比，H组足细胞密度减少（P＜0.05），T组无显著差异（P＞0.05）。
　　第四部分：Wnt/β-catenin通路在糖尿病肾病大鼠的表达及化瘀通络中药不同配伍的干预作用
　　目的：本部分研究制备 DN大鼠模型，意在探索该大鼠模型肾脏是否存在 Wnt/β-catenin通路的异常表达，以及化瘀通络中药减轻足细胞损伤、改善肾脏纤维化、减少蛋白尿的作用靶点是否与 Wnt/β-catenin通路有关。
　　方法：大鼠造模及分组同前，干预方法同前。干预第20周末，麻醉大鼠，留取部分肾皮质采用 Real-time PCR法检测 ILK， Wnt4， GSK3β，β-catenin，E-cadherin mRNA表达，免疫组化法检测 Wnt4，p-GSK3β(S9)，β-catenin，E-cadherin蛋白表达，Western-blot法检测ILK， Wnt4，p-GSK3β(S9)，GSK3β，β-catenin，E-cadherin蛋白的表达。
　　结果：
　　1.Real-time PCR检测肾组织 ILK，Wnt4，GSK3β，β-catenin，E-cadherin mRNA表达
　　与C组相比，M组大鼠ILK，Wnt4，β-catenin mRNA的表达明显升高，E-cadherin mRNA表达明显下降（P＜0.01或 P＜0.05）；与 M组相比，各干预组 ILK，Wnt4，β-catenin mRNA的表达下降（P＜0.01或 P＜0.05）， I、Z、T组 E-cadherin mRNA表达上升（P＜0.01或 P＜0.05）；与I组相比，H组β-catenin mRNA表达增多（P＜0.05），Z组E-cadherin mRNA表达增加（P＜0.05）；与 Z组相比， H组β-catenin mRNA的表达明显升高， E-cadherin mRNA表达减少（P＜0.05）。GSK3βmRNA表达各组大鼠肾组织均无显著差异（P＞0.05）。
　　2.免疫组织化学法检测肾组织 Wnt4， p-GSK3β，β-catenin， E-cadherin蛋白的表达
　　C组大鼠Wnt4蛋白仅微弱表达于部分肾小管上皮细胞中，p-GSK3β蛋白在肾小球、肾小管均有少量表达，β-catenin蛋白在部分肾小球、肾小管上皮细胞及远端小管有少量表达；与 C组相比，Wnt4、p-GSK3β、β-catenin在 M组大鼠肾小球及肾小管上皮细胞表达明显增多；与 M组比较，各干预组表达均有不同程度的下降。C组大鼠 E-cadherin蛋白主要表达在肾小管上皮细胞及部分肾小球系膜区；与 C组相比，M组 E-cadherin蛋白表达明显减少；与 M组比较，各干预组 E-cadherin蛋白有不同程度的表达增多。
　　3.Western-blot检测肾组织 ILK， Wnt4， p-GSK3β， GSK3β，β-catenin，E-cadherin蛋白的表达
　　与C组相比，M组大鼠 ILK，Wnt4，p-GSK3β，β-catenin蛋白的表达明显升高，E-cadherin蛋白表达明显下调（P＜0.01或P＜0.05）；与M组相比，各干预组 ILK，Wnt4，β-catenin蛋白的表达下降（P＜0.01或P＜0.05），I、Z、H组 p-GSK3β蛋白表达水平下降（P＜0.01或 P＜0.05），I、Z、T组 E-cadherin蛋白的表达上升（P＜0.01或 P＜0.05）；与 Z组相比，H组 E-cadherin蛋白的表达明显减少（P＜0.05）；GSK3β蛋白表达各组大鼠肾组织无显著差异（P＞0.05）。
　　结论：
　　1.模型大鼠存在明显的糖脂代谢紊乱、血小板释放功能增强及纤溶系统活性低下的病理表现，出现明显蛋白尿及肾脏病理损伤，表明 DN大鼠模型成功复制。
　　2.化瘀通络中药、化瘀中药、通络中药均可不同程度地改善 DN大鼠脂代谢紊乱、抑制异常血小板活化、改善血小板释放及纤溶功能低下的表现，减少蛋白尿排泄，减轻肾小球高灌注高滤过状态，减轻肾脏损伤，具有确切的肾脏保护作用。
　　3.化瘀通络中药、通络中药可上调整合素α3β1的表达水平，减少足细胞脱落，减轻足细胞损伤，维持肾小球滤过功能的正常，这可能是二者减少 DN大鼠蛋白尿排泄的作用机制之一；化瘀中药单独应用对足细胞脱落无明显影响。
　　4.化瘀通络中药可抑制 ILK的部分活化，对 DN大鼠肾脏 Wnt/β-catenin通路的高表达具有一定的抑制作用，这可能是该药物保护足细胞、减少蛋白尿排泄的主要途径之一。
　　5.化瘀通络中药联合应用在降低蛋白尿方面效果优于化瘀中药与通络中药单独应用，二者同时应用可能存在协同关系，其中通络中药在保护肾功能、改善血小板异常活化及纤溶功能低下等方面疗效优于化瘀中药。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠瘀血阻络相关血尿指标的干预作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠肾脏损伤的干预作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分化瘀通络中药不同配伍对糖尿病肾病大鼠肾组织整合素α3β1表达及足细胞密度的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第四部分Wnt/β-catenin通路在糖尿病肾病大鼠的表达及化瘀通络中药不同配伍的干预作用

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:“瘀血阻络”理论在糖尿病肾病的研究进展

致谢

个人简历