舒巴坦通过p38 MAPK通路介导GLT-1上调参与诱导大鼠脑缺血耐受

摘要

缺血性脑疾病以其致死率高、致残率高的特点严重威胁着人类健康。随着当前中国社会老龄化程度日益加重，以及社会生活、工作节奏的日益加快，缺血性脑疾病在临床呈现多发势态，且呈现越来越年轻化的趋势。此外，一些可以预知的临床缺血性改变，如神经外科手术、心脏外科手术、合并心脑血管疾病患者的大手术时血流的停滞带来的心、脑缺血性损伤也是亟待解决的问题。在疾病发生前后，充分调动机体内源性保护机制，使神经细胞在遭受缺血打击时减轻损伤，是此类疾病的预防和治疗过程中的关键因素之一。
　　谷氨酸是中枢神经系统内重要的兴奋性神经递质，与生理情况下大脑功能的维持密切相关。然而，在缺血性脑疾病发生时，缺血、缺氧状态的出现造成谷氨酸大量释放到突触间隙内，同时脑内的谷氨酸转运异常，使神经细胞外的谷氨酸浓度明显升高。微透析实验显示，在脑缺血发生时，脑组织细胞外的谷氨酸浓度可以由正常的1-5μM升高到16-30μM。过量的谷氨酸引起神经细胞的过度兴奋是导致神经元损伤的重要机制。因此，改善脑内谷氨酸转运过程，以维持突触间隙内谷氨酸浓度的正常是脑缺血性疾病时保护神经细胞的重要手段。
　　突触间隙内谷氨酸浓度的稳定主要依赖高亲和性兴奋性氨基酸转运体（excitatory amino acid transporters,EAATs）系统维持。至今已发现了5种高亲和性谷氨酸转运体，即EAAT1-5，其中EAAT2主要分布在星形胶质细胞的细胞膜上，又被称为胶质细胞谷氨酸转运体-1（glial glutamate transporter-1, GLT-1）。GLT-1在谷氨酸稳态维持中发挥着重要作用，突触间隙中超过90％的谷氨酸依靠GLT-1的转运而清除。在脑内谷氨酸浓度升高时，通过GLT-1的跨膜转运能高效的清除突触间隙内的谷氨酸，使其维持正常的浓度，防止谷氨酸浓度过度增高引起神经细胞的过度兴奋而造成损伤。因此，GLT-1在缺血性脑损伤的发生以及脑缺血耐受的诱导过程中发挥着重要的作用。研究显示，全脑缺血造成大鼠海马CA1区GLT-1的mRNA和蛋白合成均降低，同时海马CA1区神经元发生迟发性死亡（delayed neuronal death,DND）。我室既往研究显示，通过脑缺血预处理可以增加大鼠海马CA1区GLT-1的表达，同时神经细胞对缺血的耐受性增强；而应用反义寡核苷酸技术阻断GLT-1的表达或应用特异性抑制剂阻断GLT-1的功能后，脑缺血预处理介导的神经保护作用也被阻断。综上，对GLT-1蛋白表达和功能进行调制，有可能成为缺血性脑疾病的预防和治疗的一个新靶点。
　　既往研究表明，β-内酰胺类抗生素可以促进脑内GLT-1蛋白表达，增强星形胶质细胞对突触间隙内谷氨酸的清除能力，改善脑内谷氨酸循环过程，从而发挥神经保护作用。这一发现在神经细胞缺血耐受的研究中备受关注。研究发现，氨苄青霉素预处理可以上调GLT-1蛋白表达，抑制基质金属蛋白酶活性，从而对前脑缺血小鼠的海马神经元发挥保护作用。在大脑中动脉阻塞的局灶性缺血模型中，预先应用头孢曲松钠可以上调GLT-1表达，增强谷氨酰胺合成酶活性，使脑梗死体积明显缩小。大鼠大脑中动脉阻塞后应用头孢曲松钠，可以增强GLT-1的活性，同时使梗死区内神经营养因子增多，有效降低脑缺血造成的神经损伤。我室既往研究发现，应用头孢曲松钠预处理可以上调大鼠海马CA1区GLT-1的表达，增强胶质细胞对突触间隙内谷氨酸的摄取能力，使神经细胞在随后发生的致死性缺血打击中得以存活。这些发现在缺血性脑损伤类疾病的防治中具有积极的意义，但是鉴于头孢曲松钠为一线抗生素，抗菌作用强大，临床大量使用会带来诸如菌群失调、耐药菌株出现等多种不良后果。这些不良后果大大限制了头孢曲松钠应用于临床缺血性脑损伤的防治研究。因此，积极寻找副作用小的替代品，对上述研究成果的临床转化具有重要意义。舒巴坦（sulbactam）的化学结构中也具有β-内酰胺环，与头孢曲松钠相似，但是其抗菌作用远远弱于头孢曲松钠，临床上一般与β-内酰胺类抗生素联合用药，以增强其抗菌效应。我室在近期的研究中发现，对大鼠应用舒巴坦预处理可以通过调制海马CA1区GLT-1蛋白的表达，增强神经元的抗缺血耐受能力。鉴于舒巴坦的抗菌活性较弱，副作用较小，深入研究舒巴坦上调 GLT-1的表达和功能、进而发挥神经元保护作用的机制，可为舒巴坦在抗缺血性脑损伤方面的应用和研究提供理论和实验依据，具有重要的意义。
　　丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族，广泛分布于机体各种细胞内。MAPKs信号转导通路主要包括ERK（extracellular signal-Regulated kinase，ERK）、JNK（c-Jun N-terminal kinase,JNK）、p38 MAPK和BMK（big MAPKinase,BMK），是细胞内的重要信号转导机制，通过调节目的蛋白合成，参与细胞增殖、转化、分化及凋亡等过程。p38 MAPK属于应激性蛋白激酶，其在缺血性疾病的发病过程中发挥重要作用。在大鼠大脑中动脉栓塞局灶性脑缺血模型的研究中，通过缺氧预处理可以使梗死区周围p38 MAPK的表达增加，同时这一区域的神经细胞对缺血性打击的耐受性增强，这种保护作用随着p38 MAPK的表达被抑制而减弱。我室系列研究发现，脑缺血预处理可以适度上调p38 MAPK的表达，进而增加GLT-1的表达而诱导脑缺血耐受，应用p38 MAPK通路的特异性抑制剂或AS-ODNs阻断p38 MAPK通路的活动，脑缺血预处理诱导的脑缺血耐受效应也被阻断。
　　据此，我们设想，p38 MAPK信号通路可能参与介导舒巴坦诱导的GLT-1上调和神经细胞保护作用。为证实此设想，本研究应用大鼠全脑缺血模型，观察舒巴坦对海马CA1区p38 MAPK磷酸化蛋白（p-p38 MAPK）和GLT-1表达的影响，同时应用p38 MAPK通路特异性抑制剂SB203580，观察其对舒巴坦诱导的GLT-1表达上调和脑缺血耐受的影响，探讨p38 MAPK在舒巴坦诱导的GLT-1上调和脑缺耐受中的作用，为缺血性脑疾病的防治提供理论基础。
　　第一部分：舒巴坦对大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和GLT-1表达的影响
　　目的：
　　观察给正常大鼠或四血管闭塞全脑缺血大鼠侧脑室注射舒巴坦后，海马CA1区p-p38 MAPK和GLT-1蛋白的表达，对比p-p38 MAPK和GLT-1蛋白表达的时间关系，为确定舒巴坦通过p38 MAPK通路上调大鼠海马CA1区GLT-1的表达提供依据。
　　方法：
　　健康雄性Wistar大鼠60只，侧脑室埋置给药套管后随机分为以下几组：
　　1.溶剂对照（NS+sham）组（n=5）首先给大鼠侧脑室一次性注射舒巴坦溶剂生理盐水（normal saline，NS）10μl，之后即刻进行全脑缺血的sham手术。
　　2.舒巴坦+sham组（n=5）首先给大鼠侧脑室一次性注射舒巴坦溶液（360 nmol，10μl），之后即刻进行全脑缺血的sham手术。
　　3.全脑缺血（NS+全脑缺血）组（n=5）首先给大鼠侧脑室注射舒巴坦的溶剂NS10μl，之后即刻进行8 min的全脑缺血手术。
　　4.舒巴坦+全脑缺血组（n=5）首先给大鼠侧脑室注射舒巴坦溶液（360 nmol，10μl），之后即刻进行8 min的全脑缺血手术。
　　各组大鼠分别于侧脑室注射后6 h、12 h和48 h取材，应用免疫组织化学和western blot方法，观察海马CA1区p-p38 M APK和GLT-1蛋白的表达情况，对比p-p38 MAPK和GLT-1蛋白表达的时间关系。
　　结果：
　　免疫组化结果显示，溶剂对照（NS+sham）组大鼠海马CA1区有一定量的p-p38 MAPK和GLT-1的基础表达，呈现浅棕黄色颗粒，各时间点相比较，p-p38 MAPK、GLT-1蛋白免疫阳性染色未见明显的改变。侧脑室给予舒巴坦（舒巴坦+sham组）后，p-p38 MAPK、GLT-1蛋白的免疫阳性着色均有不同程度的上调，p-p38 MAPK阳性颗粒主要位于细胞核内，GLT-1阳性染色紧紧包绕着神经元，呈现典型的“网格”状图像；p-p38 MAPK和GLT-1两者表达上调的时间不同，与溶剂对照（NS+sham）组比较，给予舒巴坦6 h后大鼠海马CA1区p-p38 MAPK的阳性染色明显增强，达到高峰，12 h开始回落，48 h已接近溶剂对照组水平（P＜0.05）；而GLT-1的表达高峰要迟于p-p38 MAPK，在给予舒巴坦后12h GLT-1的阳性染色开始增强，48 h达到高峰（P＜0.05）。全脑缺血（NS+ischemia组）引起大鼠海马CA1区 p-p38 MAPK表达升高，表现为与溶剂对照（NS+sham）组相比较，免疫阳性染色明显增强，缺血后12 h达高峰（P＜0.05），约为溶剂对照组的2倍，48 h逐渐回落；全脑缺血后各时间点GLT-1的表达未见明显改变。舒巴坦+全脑缺血组大鼠海马CA1区p-p38 MAPK和 GLT-1的表达均有不同程度的增加，与溶剂对照（NS+sham）组相比较，p-p38 MAPK的表达在给予舒巴坦后6 h达到高峰（P＜0.05），12 h逐渐回落至sham水平；GLT-1的表达在给舒巴坦后12 h开始升高，48 h达高峰（P＜0.05）；此外，与全脑缺血（NS+ischemia）组相比较，给予舒巴坦后抑制了全脑缺血引起的海马CA1区p-p38 MAPK的过度表达，表现为表达的峰值低于全脑缺血组。
　　Western blot检测结果与免疫组化呈现相似的趋势，无论是正常大鼠还是全脑缺血大鼠，给予舒巴坦后均引起p-p38 MAPK和GLT-1蛋白表达的上调（P＜0.05），且均表现为GLT-1的表达上调的时间迟于p-p38 MAPK的表达上调，具体表达上调时间点与免疫组化结果相同。
　　综上，无论正常大鼠还是全脑缺血大鼠，应用舒巴坦预处理后海马CA1区GLT-1、p-p38 MAPK的表达均有增高，但其表达的时间呈现明显的先后顺序，GLT-1的表达上调的时间迟于p-p38 MAPK的表达上调，提示舒巴坦可能通过p38 MAPK通路促进GLT-1的表达上调。
　　第二部分：抑制p38 MAPK信号通路对舒巴坦引起的大鼠海马CA1区GLT-1蛋白上调的影响
　　目的：
　　为进一步明确p38 MAPK信号通路在舒巴坦预处理上调GLT-1表达和神经细胞保护中的作用，应用p38 MAPK信号通路的特异性抑制剂SB203580抑制p38 MAPK的功能后，分别观察舒巴坦对sham及全脑缺血大鼠GLT-1表达的影响，从而证明舒巴坦是否通过p38 MAPK信号通路介导GLT-1表达上调参与诱导脑缺血耐受。
　　方法：
　　健康雄性Wistar大鼠35只，侧脑室埋置给药套管后随机分为以下几组，每组n=5：
　　1.溶剂对照（NS+sham）组（n=5）：同第一部分；
　　2.舒巴坦（舒巴坦+sham）组（n=5）：同第一部分；
　　3.SB203580+舒巴坦组（n=5）：首先给大鼠侧脑室注射SB203580（5 nmol，10μl），30 min后按第一部分中“舒巴坦+sham组”方法，侧脑室内注射舒巴坦溶液及进行全脑缺血的sham手术；
　　4.SB203580+sham组（n=5）：首先给大鼠侧脑室注射SB203580溶液（5 nmol，10μl），随后即刻进行全脑缺血的sham手术。
　　5.全脑缺血组（NS+全脑缺血）组（n=5）：同第一部分
　　6.舒巴坦+全脑缺血组（n=5）：同第一部分；
　　7.SB203580+舒巴坦+全脑缺血组（n=5）：首先给大鼠侧脑室注射SB203580溶液（5 nmol，10μl），30 min后按第一部分“舒巴坦+全脑缺血组”的方法，进行侧脑室注射舒巴坦溶液及全脑缺血。
　　各组大鼠分别于侧脑室注射舒巴坦溶液后48 h取材，应用免疫组化和western blot的方法，观察海马CA1区GLT-1蛋白表达的变化。
　　结果：
　　免疫组化结果显示，溶剂对照（NS+sham）组大鼠海马CA1区GLT-1有一定量的表达，侧脑室给予舒巴坦（舒巴坦+sham组）后48 h，大鼠海马CA1区GLT-1的阳性染色明显增强（P＜0.05）。与舒巴坦（舒巴坦+sham）组比较，预先给予SB203580（SB203580+舒巴坦组）后海马CA1区GLT-1的阳性染色明显减弱（P＜0.05）。与全脑缺血（NS+ischemia）组相比，预先给予舒巴坦（sulbactam+ischemia）可明显上调全脑缺血大鼠海马CA1区GLT-1的表达。与舒巴坦+全脑缺血组相比较，预先给予SB203580后大鼠海马CA1区GLT-1的阳性染色明显减弱（P＜0.05）。与溶剂对照（NS+sham）组比较，单独应用SB203580后大鼠海马CA1区GLT-1蛋白阳性染色未见明显改变。
　　Western blot检测结果与免疫组化结果显示相似的趋势，无论是正常大鼠还是全脑缺血大鼠，给予舒巴坦后均可引起海马CA1区GLT-1蛋白表达的上调（P＜0.05），而应用SB203580后，均可使舒巴坦引起的海马CA1区GLT-1的表达上调明显减少（P＜0.05）。
　　上述结果表明，无论是正常大鼠还是脑缺血大鼠，应用SB203580抑制了p38 MAPK通路活性后，均显著抑制了舒巴坦介导的海马 CA1区GLT-1表达的上调，提示 p38 MAPK信号转导通路参与舒巴坦介导的GLT-1蛋白表达上调。
　　第三部分：抑制p38 MAPK信号通路对舒巴坦抗大鼠脑缺血作用的影响
　　目的：
　　本研究中第一、二部分实验结果证实，p38 MAPK参与了舒巴坦介导的大鼠海马CA1区GLT-1的表达上调。在此基础上，本部分实验进一步观察应用p38 MAPK通路的特异性抑制剂（SB203580）抑制p38 MAPK的功能后，对舒巴坦抗大鼠脑缺血作用的影响，进一步证明舒巴坦通过p38 MAPK信号转导通路介导GLT-1表达上调而发挥抗缺血性神经元损伤作用。
　　方法：
　　健康雄性Wistar大鼠25只，侧脑室预置给药套管后，随机分为以下五组，每组n=5：
　　1.Sham组：首先侧脑室注射NS10μl，2d后行全脑缺血的sham手术；
　　2.全脑缺血组：首先侧脑室注射NS10μl，2d后行8min全脑缺血；
　　3.舒巴坦+全脑缺血组：首先给大鼠侧脑室注射舒巴坦溶液（360 nmol，10μl），2d后进行8 min全脑缺血。
　　4.SB203580+舒巴坦+全脑缺血组：首先给大鼠侧脑室注射SB203580溶液（5 nmol，10μl），30分钟后给予舒巴坦（360 nmol，10μl）侧脑室注射，2d后行全脑缺血，方法同舒巴坦+脑缺血组；
　　5.SB203580+sham组：首先给大鼠侧脑室注射SB203580（5 nmol，10μl），30min后按照sham组的方法，注射NS及行脑缺血sham手术。
　　全脑缺血sham手术或全脑缺血再灌注后7 d断头处死动物，分离双侧海马，4%多聚甲醛固定，常规石蜡包埋切片，硫堇染色，通过分析比较大鼠海马CA1区神经元的组织学分级（histological grading,HG）和神经元密度（neuronal density,ND），确定不同条件下神经元迟发型死亡情况，评价舒巴坦的抗缺血性神经元损伤作用。
　　结果：
　　sham组大鼠海马CA1区神经元约为3-4层，整齐、致密排布，可见清晰、完整的细胞轮廓，胞内可见大量尼氏体着色，细胞核充实饱满，核仁清晰可见。HG为0-Ⅰ级，ND为198.6±7.89（cells/mm，下同）。给予8 min全脑缺血，引起了海马CA1区明显的神经元损伤，镜下可以看到大片锥体神经元破坏、死亡，细胞排列疏松、紊乱，散在大量细胞碎片，残存的细胞收缩，呈不规则状，核浓染，核仁消失；与sham组相比较，HG（Ⅱ-Ⅲ级）明显升高（p＜0.01），ND（51.8±7.40）明显减低（p＜0.01）。舒巴坦+缺血组仅有散在细胞死亡，大部分细胞可见清晰、完整的细胞轮廓，整齐排列，层次清晰；与全脑缺血组相比较，HG（Ⅰ-Ⅱ级）明显减低（p＜0.05），ND明显升高（p＜0.05），为188.6±12.76。这些结果表明，舒巴坦可发挥神经细胞保护作用，使神经细胞对缺血打击的耐受性增强。预先给予SB203580（SB203580+舒巴坦+缺血组）阻断了舒巴坦介导的这种神经保护作用，镜下可见海马CA1区分布着大量死亡的神经细胞碎片及不规则形状的残存细胞，细胞核深染，核仁消失；与舒巴坦+缺血组相比，HG明显增高（Ⅱ-Ⅲ级）（P＜0.05），ND明显减低52.2±6.61（P＜0.05）。单独应用SB203580（SB203580+sham组）未造成大鼠海马CA1区的神经元的明显改变，与sham组相比，其HG（0-Ⅰ）和ND（200.2±6.38）没有明显的改变（P＞0.05）。
　　上述结果提示，舒巴坦预处理在缺血再灌注过程中有效发挥神经细胞保护作用，p38 MAPK通路特异性抑制剂SB203580可以阻断舒巴坦介导的这种保护作用。
　　结论：
　　1.舒巴坦预处理可以上调正常和全脑缺血大鼠海马CA1区 p-p38 MAPK和GLT-1蛋白的表达，且GLT-1的表达上调迟于p-p38 MAPK的表达上调。
　　2.应用SB203580抑制p38 MAPK信号通路阻断了舒巴坦引起的大鼠海马CA1区GLT-1蛋白上调。
　　3.应用SB203580抑制p38 MAPK信号通路阻断了舒巴坦诱导的海马锥体神经元的缺血耐受。
　　4.以上表明，舒巴坦预处理可通过p38 MAPK通路介导GLT-1表达上调参与诱导大鼠脑缺血耐受。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分舒巴坦对正常及全脑缺血大鼠海马CA1区p38 MAPK和GLT-1表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第二部分抑制p38 MAPK信号通路对舒巴坦引起的大鼠海马CA1区GLT-1蛋白表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

第三部分抑制p38 MAPK通路对舒巴坦抗大鼠脑缺血作用的影响

前言

材料与方法

结果

附图

讨论

小结

参考文献

结论

综述:缺血/缺氧耐受研究进展

致谢

个人简历