PTEN对创伤后应激障碍大鼠海马神经元自噬与凋亡的影响及机制研究

摘要

创伤后应激障碍（posttraumatic stress disorder，PTSD）是指由灾难性事件或者非常严重的威胁性事件所导致的心理创伤，从而导致患者延迟出现持续性地精神障碍。其发病率高、疗效差、病程长，是最典型的应激疾病之一，已成为目前的研究热点。PTSD核心症状为闯入性创伤再体验、警觉性增高及反应麻木。有研究表明：PTSD患者的海马部分体积缩小，提示PTSD海马神经元发生了异常丢失和死亡，动物实验结果表明，海马部位存在神经元凋亡现象。Beclin1（自噬基因Beclin1产物）参与自噬体的早期形成过程，其可以正向调节自噬的发生。研究发现，在成年大鼠海马部位存在Beclin1的表达，提示该部位可能存在细胞自噬现象。推测PTSD发病过程中海马神经元的异常丢失和死亡不仅可能与神经元凋亡有关，还可能同时存在自噬水平上调。
　　第10号染色体缺失的磷酸酶和张力蛋白同源等位基因（Phosphatase and tension homolog，PTEN）具有磷酸酶活性，使三磷酸磷脂肌醇PIP3去磷酸化生成二磷酸磷脂肌醇PIP2，从而负性调节PI3K/Akt信号通路，减弱来自于PI3K/Akt/mTOR信号传导通路上游的信号强度，达到抑制细胞增殖和促进细胞凋亡的作用。有研究表明PTSD大鼠PTEN表达增高，推测PTEN与PTSD海马神经元自噬和凋亡存在重要联系，但目前少见报道。PTEN在PTSD海马神经元自噬和凋亡过程中的作用及其信号转导途径还有待进一步深入研究。
　　本研究应用改良单一连续性应激(single-prolonged stress＆shock, SPS＆S应激)大鼠PTSD动物模型，探讨了PTSD大鼠行为学变化与海马神经元形态改变的关系，并对PTEN基因对PTSD海马神经元自噬和凋亡的影响及其信号转导机制进行了研究。
　　第一部分：PTSD大鼠行为学及海马神经元形态改变
　　目的：
　　研究PTSD大鼠行为学变化及海马神经元形态改变。采用 SPS＆S应激建立PTSD模型，通过穿梭箱、旷场实验和Morris水迷宫实验检测大鼠行为学改变；大鼠脑组织石蜡包埋切片，HE染色观察海马神经元形态学改变。从行为学和形态学两方面探讨PTSD大鼠海马神经元结构功能是否异常。
　　方法：
　　1.建立PTSD大鼠模型：实验选用SPF级成年雄性SD大鼠60只，适应性饲养7天后，随机分成对照组和模型组，每组各30只。对照组不作处理，模型组给予SPS&S建立PTSD模型。PTSD模型建立方法：首先给予单一连续应激(single-prolonged stress，SPS)，包括禁锢2h、强迫游泳20min(水深40cm，水温25℃)、乙醚麻醉至大鼠意识丧失，顺序进行。自然苏醒后给予不可回避的足底电击(电流强度8mA，持续时间10sed)。处理结束后常规饮食，无干扰饲养7天，模型制备完成。
　　模型制备完成后两组大鼠开始行为学检测，包括穿梭箱实验、旷场实验和Morris水迷宫实验。
　　2.穿梭箱实验：随机选取对照组和模型组大鼠各10只，每次将一只实验大鼠放入穿梭箱，先给予声光刺激10秒钟，后给予强度为8mv的持续足底电击10秒。记录测试大鼠主动逃避时间、行动路线等参数和轨迹。每只大鼠每次测试20个循环，连续测试5天，前4天为训练，第5天的数据作为测试成绩。
　　3.旷场实验：随机选取对照组和模型组大鼠各10只，记录每只大鼠在旷场中的活动时间和总路程，及直立次数，时间为5分钟。
　　4.Morris水迷宫：随机选取对照组和模型组大鼠各10只，实验包括隐蔽站台试验和空间探索试验。隐蔽站台试验时，将鼠任意从四个象限之一面向池壁放入水中，每次实验鼠共游泳90s来寻找隐藏的站台。记录其游泳路径及寻找池中隐僻平台的时间，即逃避潜伏期(escape latency，EL)。空间探索试验时，撤除站台，任选相同入水点将大鼠放入水中，记录其60s内的游泳路径、在原站台象限的停留时间和穿越原站台次数。
　　5.大鼠脑组织石蜡包埋切片，HE染色观察两组大鼠海马神经元形态学改变。
　　实验中所得数据均用xˉ±s表示，用SPSS16.0统计软件进行统计分析，两两比较采用独立T检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.PTSD大鼠模型制备成功。
　　2.PTSD大鼠主动逃避反应延迟，学习记忆能力下降；警觉水平和焦虑状态提高，环境适应能力下降；空间学习记忆能力受损伤。
　　3.形态学改变：模型组大鼠海马神经元减少，排列紊乱，出现核固缩、深染。
　　小结：
　　PTSD大鼠学习记忆能力下降，警觉水平和焦虑状态提高；海马神经元形态异常。
　　第二部分：PTEN对PTSD大鼠海马神经元自噬和凋亡的影响
　　目的：
　　检测PTEN基因在PTSD大鼠海马神经元中的表达，并探讨PTEN基因在PTSD大鼠海马神经元自噬和凋亡中的作用。
　　方法：
　　1.检测PTEN基因在PTSD大鼠海马神经元中的表达。
　　1)分组：90只SPF级成年雄性SD大鼠，随机分成对照组和模型组，每组45只。对照组不作处理，模型组建立PTSD模型。将两组大鼠随机分为5个时相点:1d、3d、7d、14d和28d取材，每个时相点9只。
　　2)免疫印迹分析两组大鼠PTEN蛋白表达，以目标蛋白平均灰度值/内参平均灰度值的比值进行半定量分析；
　　3)Real-time PCR技术测定PTEN mRNA表达，采用CT值的相对定量法来分析PCR结果；
　　4)免疫荧光技术检测PTEN蛋白表达，计算机进行数据采集和成像。
　　2.PTEN基因在PTSD大鼠海马神经元自噬和凋亡中的作用。
　　1)构建PTEN基因重组腺病毒。
　　2)分组：80只SPF级成年雄性SD大鼠，随机分成对照组、模型组、转染组和PTEN抑制剂bpv组，每组20只。对照组不做任何处理，模型组在造模前活体转染表达GFP的空病毒（Ad-GFP），转染组在造模前活体转染重组腺病毒（Ad-PTEN-GFP），bpv组在造模前腹腔注射PTEN抑制剂bpv。
　　3)Morris水迷宫实验：检测各组大鼠行为学改变。
　　4)免疫印迹技术检测各组大鼠海马神经元自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin1表达，分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值改变。检测各组大鼠海马神经元凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的含量、分析Bax/Bcl-2比值改变。
　　5)Real-time PCR技术检测各组大鼠海马神经元LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ和Beclin1的mRNA表达。
　　6)TUNEL法检测各组大鼠海马神经元凋亡细胞，计数阳性细胞数及细胞总数，计算凋亡指数。
　　7)透射电镜技术观察各组大鼠海马神经元自噬体、自噬溶酶体和神经元凋亡及超微结构改变。
　　实验中所得数据均用xˉ±s表示，用SPSS16.0统计软件进行单因素方差分析，两两比较采用独立T检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.PTEN在PTSD大鼠海马神经元中表达。
　　1)模型组海马PTEN蛋白表达水平明显上调，在3d时升高，7d时达到高峰，之后逐渐下降，但28d时仍高于对照组。
　　2)模型组海马PTEN的mRNA水平明显上调，1d时为对照组的1.12倍，3d时为1.48倍，7d时达到高峰为3.83倍，14d时开始下降为1.21倍，28d时为1.05倍。
　　3)模型组海马神经元PTEN荧光强度明显提高，3d时升高，7d时达到高峰，之后逐渐下降，但28d时仍高于对照组。
　　2.PTEN基因对PTSD大鼠海马神经元自噬和凋亡中的作用。
　　1)MWM实验显示：逃避潜伏期和总路程：转染组>模型组>bpv组>对照组；原站台象限的停留时间和穿越原站台次数：对照组>bpv组>模型组>转染组。
　　2)免疫印迹显示：自噬相关蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值：转染组>模型组>bpv组>对照组；Beclin1蛋白表达水平：转染组>模型组>bpv组>对照组。凋亡相关蛋白Bcl-2和Bax表达水平检测的结果：Bcl-2蛋白表达水平：对照组>bpv组>模型组>转染组。Bax蛋白表达水平：转染组>模型组>bpv组>对照组。
　　3)Real-time PCR显示：LC3-Ⅱ/LC3-ⅠmRNA比值：转染组>模型组>bpv组>对照组。Beclin1的mRNA表达水平：转染组>模型组>bpv组>对照组。
　　4)TUNEL法显示：凋亡神经元表现为细胞核染成棕黄色，染色质凝集。对照组存在少量散在的TUNEL阳性细胞，CA1区AI为5.90％；模型组CA1区AI为26.08%；bpv组CA1区AI为19.98%；转染组CA1区AI在四组中最高，为38.08%。
　　5)透射电镜观察：模型组海马神经元出现凋亡早期改变：细胞皱缩，染色质边集。转染组海马神经元超微结构受损严重，细胞核裂解，出现凋亡小体。bpv组海马神经元超微结构受损情况较模型组有所改善，转染组海马神经元超微结构受损严重，细胞核裂解，可见凋亡晚期神经元和凋亡小体；对照组中偶见吞噬泡和自噬小体，模型组、bpv组和转染组可见到自噬小体和自噬溶酶体。转染组自噬小体和自噬溶酶体数量较多。
　　上述结果均有统计学意义(P<0.05)。
　　小结：
　　1.PTSD模型大鼠海马神经元PTEN表达升高。
　　2.PTSD海马神经元发生显著自噬和凋亡。
　　3.PTEN对PTSD海马神经元的自噬和凋亡具有调控作用。
　　第三部分：PTEN基因调控PTSD大鼠海马神经元自噬和凋亡的机制研究
　　目的：
　　探讨PTEN基因调控PTSD大鼠海马神经元的凋亡和自噬的信号转导途径。
　　方法：
　　1.检测PTSD大鼠海马神经元PI3K/Akt/mTOR信号通路的改变。
　　1)分组：50只SPF级成年雄性SD大鼠，随机分成对照组和模型组，每组25只。每组大鼠随机分为5个时相点：1d、3d、7d、14d和28d取材，每个时相点5只。
　　2)免疫印迹技术检测PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白PTEN、p-Akt、p-mTOR、p4E-BP1、p-p70S6K、p-eIF4B、p-eIF4E蛋白表达。
　　2.检测PTEN是否通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控PTSD大鼠海马神经元凋亡和自噬。
　　1)分组：60只SPF级成年雄性SD大鼠，随机分成对照组、模型组、LY294002组和rapamycin组，每组15只。LY294002组大鼠造模前于海马部位显微注射PI3K/Akt特异性抑制剂LY294002。rapamycin组大鼠造模前于海马部位显微注射mTOR特异性抑制剂雷帕霉素（rapamycin）。
　　2)免疫印迹技术检测各组大鼠海马神经元自噬相关蛋白LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ表达水平，分析LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值改变。
　　3)流式细胞术检测各组大鼠海马神经元凋亡率。
　　3.神经元凋亡和自噬的相关性分析。
　　免疫荧光双标技术共定位检测海马神经元自噬相关蛋白Beclin1和凋亡相关蛋白Caspase-3，分析PTSD大鼠海马神经元凋亡和自噬的相关性。
　　实验中所得数据均用xˉ±s表示，用SPSS16.0 for windows统计软件进行单因素方差分析，两两比较采用独立T检验。以P<0.05表示差异有统计学意义。
　　结果：
　　1.PTSD大鼠海马PI3K/Akt/mTOR信号通路关键蛋白PTEN、p-Akt、p-mTOR、p-4E-BP1、p-p70S6K、p-eIF4B蛋白在对照组均仅有少量表达且各时相点间无明显差异，模型组中表达均有明显升高，两组之间有差异(P<0.05)。模型组各蛋白在各时相点存在先升后降的变化趋势，其中PTEN蛋白7d时达高峰，p-AKT蛋白1d时达高峰。p-eIF4B：对照组和模型组均只有少量蛋白表达，两组之间无差异(P＞0.05)。
　　2.PTEN通过PI3K/Akt/mTOR信号通路调控PTSD大鼠海马神经元凋亡和自噬。
　　1)免疫印迹技术分析显示：与对照组相比较，模型组海马组织中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值升高。LY294002组和rapamycin组中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值均高于模型组。
　　2)凋亡检测显示：与对照组相比较，模型组海马组织中Caspase-3蛋白表达水平升高。LY294002组和rapamycin组海马组织中Caspase-3蛋白表达水平高于模型组。
　　3)流式细胞术检测显示：对照组海马神经元凋亡率为5.83±0.10，模型组：9.24±0.46；LY294002组：27.24±1.27；rapamycin组：21.22±1.82。其中模型组高于对照组，LY294002组和rapamycin组均较模型组有所升高。
　　以上结果均有统计学意义(P<0.05)。
　　3.神经元凋亡和自噬的相关性：免疫荧光双标技术检测显示对照组存在微量的Beclin1和Caspase-3表达。模型组Beclin1和Caspase-3表达增强，且两者呈现共定位。与模型组相比，LY294002组和rapamycin组Beclin1和Caspase-3表达明显增强，两者呈现共定位。
　　小结：
　　1.PTSD后海马组织中PI3K/Akt/mTOR信号通路激活，关键蛋白磷酸化增强，经由eIF4B介导的翻译起始步骤可能受到了损害。
　　2.PTEN对PTSD海马神经元自噬和凋亡的调控作用是通过PI3K/Akt/mTOR途径来实现的。
　　3.PTSD发病机制中神经元的自噬和凋亡呈共定位。
　　结论：
　　1.PTSD大鼠海马神经元自噬和凋亡水平上调，行为学检测PTSD大鼠学习记忆能力下降，警觉水平和焦虑状态提高。
　　2.PTEN对PTSD海马神经元的自噬和凋亡具有调控作用：PTSD大鼠海马神经元PTEN表达上调并促进海马神经元的自噬和凋亡的发生；抑制PTEN活性则使PTSD大鼠海马神经元的自噬和凋亡水平下降。
　　3.PTEN对 PTSD海马神经元的自噬和凋亡的调控作用是通过PI3K/Akt/mTOR途径来实现的。
　　4.PTSD海马神经元自噬和凋亡共定位表达，呈正相关。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分PTSD大鼠动物模型建立及行为学检测

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分PTEN对PTSD大鼠海马神经元自噬和凋亡的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分PTEN基因调控PTSD大鼠海马神经元自噬和凋亡的机制研究

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:创伤后应激障碍的研究进展

致谢

个人简历