丹参有效成份配伍配比对血管外膜成纤维细胞和自发性高血压大鼠模型的作用及其机制研究

摘要

第一部分：均匀设计与正交设计联用筛选丹参有效成份抑制成纤维细胞增值的最佳配伍配比
　　目的：丹参是我国用于治疗心脑血管疾病的传统中药，包含4种主要水溶性成份：丹参素（DSS，S）、丹酚酸A（Sal-A，A）、丹酚酸B（Sal-B，B）和原儿茶醛（PAL，P），我们简称为（SABP）。大量的研究已经证实，每种成份都可通过不同的作用机理起到心血管保护作用。血管外膜成纤维细胞（adventitial fibroblast,AF）作为一个生物学处理中心从外向内（outside-in）调节血管的结构和功能，血管在应答应激和损伤的过程中，AF首先被快速激活，通过本身改编而显示不同功能和结构的行为，被视为血管应答的始动因素。目前中药有效成份配伍研究已经成为中药创新研究的一种新模式。因此，我们设想运用均匀设计和正交设计联合应用的方法，通过观察其对AF增殖的作用，找出丹参4种主要水溶性成份的最佳配伍配比关系。
　　方法：
　　本实验选用成年Sprague Dawley（SD）大鼠，培养其胸主动脉外膜成纤维细胞，运用MTT方法，观察药物对其增殖的抑制作用，应用酶标仪读取结果并计算抑制率。
　　筛选步骤如下：
　　1、初步筛选注射用丹参（冻干）粉（salvia miltiorrhiza lyophilized powder,SMLP）及丹参的四种有效成份各自的有效应用剂量范围。
　　2、采用均匀设计和正交设计联用的方法，进行成份剂量和配伍的筛选。
　　3、把实验得到的最优组合再次排列组合进行验证。
　　结果：
　　1.药物浓度初筛结果：每种药物对AF的抑制率最显著的有效浓度范围是：Sal-A，Sal-B，DSS的有效浓度范围都是（10-3mol/L，10-4 mol/L，10-5 mol/L），PAL的有效浓度范围是（10-2 mol/L，10-3 mol/L，10-4 mol/L），但是SMLP对血管外膜成纤维细胞无明显的抑制作用，且各浓度之间没有统计学差异；
　　2.均匀设计实验结果：结合初筛药物浓度实验得到的结果，四个成份各选取有效剂量范围内6个不同浓度，然后按照均匀设计表，即4因素6水平均匀表 U6（64）安排实验，结果显示第3组是最有效的配伍组合，抑制作用最显著，有统计学差异。即：S3（10-4 mol/L），A6（10-6 mol/L）， B2（5×10-4 mol/L），P4（5×10-4 mol/L）；
　　3交设计实验结果：结合均匀设计实验得到的结果，在最优的处理中，根据各成份对应剂量相距较近的范围内，再次选择低、中、高3个不同剂量，对DSS、Sal-A、Sal-B、PAL四个成份的有效剂量低、中、高进行正交设计实验研究，选择 L9（34）正交表，结果显示第6组是抑制作用最显著的配伍组合，具有统计学差异。即：S2（1.5×10-4 mol/L），A3（7×10-6 mol/L），B1（3×10-4 mol/L），P2（5×10-4 mol/L）；
　　4丹参4种成份再次进行排列组合，进一步验证最佳配伍配比。根据均匀设计和正交设计的结果，为各成份确定一个最适宜有效剂量，对DSS、Sal-A、Sal-B、PAL四个成份再次排列组合：S、A、B、P，SA、SB、SP、AB、AP、BP、SAB、SAP、SBP、ABP、SABP共15个，再次考察各种配伍组合对AF增殖的影响，结果显示SABP组的抑制率最大，为最佳配伍配比组合。
　　结论：
　　本实验运用均匀设计和正交设计联合应用的实验方法，筛选出丹参的四种主要水溶性成份（DSS、Sal-A、Sal-B、PAL），抑制血管外膜成纤维细胞增殖的最佳配伍配比关系和浓度，即 S（1.5×10-4 mol/L），A（7×10-6 mol/L），B（3×10-4 mol/L），P（5×10-4 mol/L），比例为（150︰7︰300︰500），且四种成份之间还存在一定的协同作用。
　　第二部分：丹参有效成份的最佳配伍配比对自发性高血压大鼠血管重构的保护作用
　　目的：
　　血管重构（vascular remodeling，VR）是高血压病心、脑、肾等靶器官损害的共同病理基础，主要表现有血管壁中层平滑肌细胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）肥大、增生及细胞外基质（extracellular matrixc，ECM）增多，外膜增厚不规则，导致管壁增厚变硬、顺应性下降等，随即导致血管功能的异常。血管紧张素Ⅱ（angiotensin，Ang-II）和内皮素（endothelin，ET）是主要的缩血管因子，α-SMA是VSMC和AF转化成肌成纤维细胞（migratory myofibroblasts，MF）的标志物，Ⅰ型胶原蛋白（Collagen TypeⅠ，Col-Ⅰ）是ECM的主要成份，它们都与血管结构改变密切相关。本实验选用与人类高血压发病机制相似的自发性高血压大鼠为模型（spontaneously hypertensive rats，SHR），观察SABP对其血压的影响以及血管重构的作用。
　　方法：
　　实验动物随机分为5组：
　　（1）正常对照组（WKY）；
　　（2）模型组（SHR）；
　　（3）西药培哚普利（PD）组（SHR）；
　　（4）注射用丹参（冻干）粉组（salvia miltiorrhiza lyophilized powder，SMLP）组（SHR）；
　　（5）丹参四成份最佳配伍配比（SABP）组（SHR）。
　　每天腹腔注射给药：SMLP（1 g/kg/d）；PD（0.4 mg/kg/d）；SABP（DSS:5 mg/kg/d，Sal-A:0.233 mg/kg/d，Sal-B:10 mg/kg/d，PAL:17 mg/kg/day）；SHR和WKY对照组给予等量的生理盐水。给药前及给药期间，每2W测量一次动物尾动脉血压。给药8W后，留取每只动物的血浆及胸主动脉，用于酶联免疫吸附剂测定（ELISA）、常规HE染色、免疫组织化学染色、R-T PCR和Western Blot实验。
　　结果：
　　1.SABP可显著降低SHR收缩压，但最终并没有降至正常水平。SABP组与PD组在整个给药过程中，都使血压稳步下降。两组相比降压效果无明显差别。SMLP无明显降压效果，其与SHR组相比无明显差别，无统计学意义；
　　2.SABP可显著降低SHR血浆中Ang-II和ET-1的含量。PD组Ang-II、ET-1下降效应与SABP组类似。SMLP组血浆中Ang-II和ET-1含量与正常SHR组无明显变化，无统计学差异；
　　3.SABP可显著改善SHR胸主动脉重构。HE染色观察显示：SHR组胸主动脉内皮细胞偶有脱落，VSMC肥大增生明显，外膜及管壁显著增厚；SABP组胸主动脉内皮细胞未脱落，无血细胞粘附，VSMC增生不明显，管壁无明显增厚；PD组血管病理形态观察与SABP组和WKY组相似。SMLP组与SHR组相似；
　　SABP组较SHR主动脉管壁厚度（Mediathickness，MT）、管壁厚度/半径（vessel wall thickness/radius，VT/VA）、外膜厚度（adventitia thickness of the thoracic aorta，AT）均显著降低，此效应与PD组相似。而SMLP组对动脉结构的作用相比SHR组无明显变化；
　　4.免疫组化观察显示：SABP组较SHR组Col-I和ET-1的表达显著降低，与WKY组相比较，Col-I和ET-1表达无明显变化。但是SMLP组Col-I和ET-1较SHR组比较，变化无统计学差异；
　　5.SABP可明显降低SHR胸主动脉上Col-I、ET-1和α-SMA的mRNA的表达，SABP的这一效应与西药培哚普利和WKY组无显著差异;
　　6.SABP可显著降低SHR胸主动脉上Col-I、ET-1和α-SMA蛋白的表达。
　　结论：
　　SABP可明显降低 SHR收缩压，降低血浆中Ang-II和ET-1水平，显著改善胸主动脉的血管重构，减少血管壁α-SMA、Col-Ⅰ和ET-1的表达，从而减少血管壁厚度和外膜的厚度。其具有明显的降压和血管重构的保护作用。
　　第三部分：丹参有效成份的最佳配伍配比减缓自发性高血压大鼠血管重构的作用机制
　　目的：
　　氧化应激是导致高血压的重要因素之一，是由于体内蓄积过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）而触发细胞损伤，从而导致血管重构。NADPH氧化酶（NOX）是心血管系统产生ROS的主要来源，且主要集中在血管外膜上。研究表明NOX4在血管壁全层都有表达。超氧化物歧化酶（SOD）是体内主要的抗氧化酶，主要用来反映机体内的抗氧化能力；丙二醛（MDA）通常用来表示机体总的脂质过氧化水平。转化生长因子-β（transforming growth factor-beta，TGF-β）是调节AF/MF以及 Col-I的最重要的因子之一。TGF-β/Smad是其经典的信号转导通路， Smad7是这一通路中重要的负向调节因子。本研究选用SHR和SD大鼠AF为模型，探讨 SABP对其氧化应激的影响，并观察其对胸主动脉上NOX4、TGF-β1和Smad7表达的影响。
　　方法：
　　实验动物随机分为5组：
　　（1）正常对照组（WKY）；
　　（2）模型组（SHR）；
　　（3）PD组（SHR）；
　　（4）SMLP组（SHR）；
　　（5）SABP组（SHR）。
　　每天腹腔注射给药：SMLP（1 g/kg/d）；PD（0.4 mg/kg/d）；SABP（DSS:5 mg/kg/d，Sal-A:0.233 mg/kg/d，Sal-B:10 mg/kg/d，PAL:17 mg/kg/day）；SHR和WKY对照组给予等量的生理盐水。给药8 W后，留取每只动物的血浆及胸主动脉，用于ELISA、免疫组织化学染色、R-T PCR和Western Blot实验。
　　培养SD大鼠胸主动脉外膜AF，并分为四组：
　　（1）Ang-Ⅱ（10-6 mol/L）组；
　　（2）荧光剂对照组，荧光剂为 DCFH-DA（10-5 mol/L）；
　　（3）Ang-Ⅱ+SABP组，Ang-Ⅱ药物浓度同上，SABP（DSS:1.5×10-4 mol/L，Sal-A:7×10-6 mol/L，Sal-B:3×10-4 mol/L，PAL:5×10-4 mol/L）组。
　　（4）SABP组（药物浓度同上）。每组均加用荧光剂。用荧光酶标仪在502nm处检测荧光值，并用荧光显微镜拍照。
　　结果：
　　1.SABP可显著降低SHR血浆中MDA和TGF-β1的含量，并显著升高SOD的含量；
　　2.免疫组化染色显示：SABP可显著降低 SHR组胸主动脉上 NOX4和TGF-β1的表达，且与WKY组相比较，NOX4和TGF-β1表达无明显变化，差异无统计学意义。这一效应与PD组相似；
　　3.SABP可明显降低SHR胸主动脉上NOX4的mRNA水平及蛋白表达。与西药培哚普利和WKY组的NOX4的表达效应相似；
　　4.SABP可显著降低用Ang-Ⅱ刺激的SD大鼠AF中ROS含量。SABP组和Ang-Ⅱ+SABP组与空白对照组相比均无明显差别，没有统计学意义；
　　5.SABP可明显降低SHR胸主动脉上TGF-β1mRNA水平及蛋白表达，且显著升高Smad7的mRNA及蛋白的表达。
　　结论：
　　SABP既可显著降低 SHR体内的氧化应激水平，降低血浆中MDA水平，升高SOD水平；降低胸主动脉NOX4表达；也可降低Ang-Ⅱ刺激的SD大鼠AF中ROS含量；而且SABP还可降低TGF-β1表达，升高Smad7蛋白表达。SABP通过抑制氧化应激和 TGF-β1的表达，升高Smad7蛋白表达，进而抑制高血压大鼠的血管重构。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分均匀设计与正交设计联用筛选丹参有效成份抑制成纤维细胞增值的最佳配伍配比

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分丹参有效成份的最佳配伍配比对自发性高血压大鼠血管重构的保护作用

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分丹参有效成份的最佳配伍配比减缓自发性高血压大鼠血管重构的作用机制

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

结论

综述:外膜成纤维细胞介导的血管病变的研究进展

致谢

个人简历