左乙拉西坦对大鼠癫痫持续状态后海马区脑水肿及海马区水通道蛋白4表达的影响及其机制探讨

摘要

广义癫痫持续状态（status epilepticus）为出现两次以上的癫痫发作，发作间期意识未完全恢复；或者一次癫痫发作持续30分钟以上。癫痫持续状态是神经外科常见的急危重症之一，其病死率、致残率均较高。癫痫持续状态可导致人或大鼠脑组织水肿（brain edema），是癫痫持续状态的重要病理环节之一，也是导致癫痫持续状态急性致死和致残的重要原因。脑水肿是指液体的过度渗透和聚集而致脑组织容量增加的临床综合征。水通道蛋白4（AQP4）介导水分子快速跨膜转运，在脑水肿的形成和清除中发挥关键作用。左乙拉西坦除抗癫痫作用外还具有抗凋亡、抑制胶质细胞增生和减轻脑水肿等神经保护作用。
　　本研究旨在通过氯化锂-匹鲁卡品制作SD大鼠癫痫持续状态性脑水肿模型并给以左乙拉西坦干预，研究SD大鼠癫痫持续状态后海马区脑水肿的变化趋势及海马区水通道蛋白4的表达趋势，分析脑水肿与AQP4是否相关。探讨左乙拉西坦能否降低SD大鼠癫痫持续状态后海马区脑水肿及海马区水通道蛋白4的表达，并进一步观察左乙拉西坦是否通过下调海马区AQP4的表达来降低脑水肿，为左乙拉西坦减轻癫痫持续状态性脑水肿提供理论依据。
　　第一部分：大鼠癫痫持续状态后海马区脑水肿及海马区水通道蛋白4的表达及水通道蛋白4与脑水肿的关系
　　目的：研究SD大鼠癫痫持续状态后海马区脑水肿的变化趋势及海马区水通道蛋白4的表达趋势，分析脑水肿与AQP4是否相关。
　　方法：成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠96只，体重280～320g，随机分为2组：假手术组(SO group, n=48)，癫痫持续状态组(SE group, n=48)，SO和SE组大鼠又根据癫痫持续状态后2h，6h，12h，24h，3d，7d六个时间点随机分为6个亚组，每组8只。SE组大鼠腹腔内注射氯化锂（127 mg/kg），20小时后腹腔注射匹鲁卡品（25mg/kg）诱导癫痫持续状态模型。SO组大鼠腹腔内仅注射氯化锂。在相应时间点，各组动物腹腔注射10％水合氯醛(0.3g/Kg)麻醉后，以4%多聚甲醛心脏灌注，断头开颅取双侧海马组织。右侧海马组织分为两部分，一部分置于液氮中﹣80℃冰箱保存，用于western blot analysis和 real time polymerase chain reaction(RT-PCR)，另一部分用于脑水肿测量。左侧海马组织也分为两部分，分别用于HE染色和透射电镜观察。
　　结果：
　　1.组织学和超微结构观察
　　SO组大鼠海马CA3区神经元形态正常，神经元丰富，排列整齐且密集。锥体细胞排列规则，细胞的突起和核仁明显。SE大鼠海马CA3区正常神经元数量减少，神经元排列不规则，稀疏。神经元细胞水肿变性，细胞间隙增宽，细胞突起减少，核仁模糊，胞浆淡染。胶质细胞不同程度的增生。SE组大鼠癫痫持续状态后2h-12h神经元周围间隙增宽，细胞水肿呈气球样变，并逐渐加重。癫痫持续状态后24h神经元水肿达顶峰，表现为空泡细胞。水肿持续到3d，较24h有所缓解，开始出现胶质细胞增生和炎性细胞浸润。癫痫持续状态后7d细胞水肿基本消退。投射电镜观察SO组大鼠海马CA3区神经元形态正常，多为锥体形或者多角形。神经元排列规则且紧密，染色质均匀一致。SE组大鼠海马神经元数量减少，排列紊乱。神经元的细胞浆和细胞核水肿。线粒体水肿变性，线粒体的嵴排列紊乱或断裂，甚至缺失。
　　2.大鼠海马区脑含水量测定
　　与SO组相比，SE组在2h-12h逐渐升高(75.76±1.12，79.77±1.12，81.62±1.39，P<0.05)，24h达到顶峰(82.41±1.66, P<0.05)，3d开始下降（81.41±1.41，P<0.05），7天明显下降（77.80±0.75，P<0.05），但仍高于正常。
　　3.Western Blot测定海马区AQP4的表达
　　与SO组相比，SE组在2h-12h逐渐升高（0.141±0.028,0.164±0.020，0.236±0.017，P<0.05），24h达顶峰（0.248±0.025，P<0.05），3d开始下降（0.206±0.021，P<0.05），7d后明显下降(0.163±0.014，P<0.05)，但仍高于正常。
　　4.RT-PCR检测海马区AQP4 mRNA的表达
　　与SO组相比，SE组在2h-12h逐渐升高（1.185±0.052，1.325±0.061，1.473±0.087， P<0.05），24h达顶峰（1.636±0.055，P<0.05），3d开始下降（1.441±0.080，P<0.05），7d后明显下降(1.203±0.050，P<0.05)，但仍高于正常。
　　5.AQP4的表达和脑水肿的关系
　　在同一时间点，随着脑组织 AQP4的表达增高，脑组织含水量相应的升高。直线相关性分析显示：SE组AQP4蛋白，脑组织含水量， AQP4mRNA表达之间呈明显正相关(P<0.05)。
　　结论：
　　1.癫痫持续状态后2h脑含水量和海马区AQP4表达增加，24h达高峰，持续3d后下降，7d后接近正常。
　　2.癫痫持续状态后AQP4蛋白、脑组织含水量、AQP4mRNA表达之间呈明显正相关。
　　3下调AQP4蛋白表达可能是治疗癫痫持续状态后海马区脑水肿的一种新思路。
　　第二部分：左乙拉西坦对大鼠癫痫持续状态后海马区脑水肿及海马区水通道蛋白4表达的影响
　　目的：探讨左乙拉西坦（LEV）能否降低SD大鼠癫痫持续状态后海马区脑水肿，并进一步观察左乙拉西坦是否通过下调海马区AQP4蛋白的表达来降低脑水肿。
　　方法：成年雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠192只，体重280～320g，随机分为4组：假手术组(SO group, n=48)，癫痫持续状态组(SE group, n=48)，左乙拉西坦低剂量组(LL group, n=48)和左乙拉西坦低高剂量组(LH group, n=48)。其中SE组、LL组和LH组大鼠又根据癫痫持续状态后2h，6h，12h，24h，3d，7d六个时间点随机分为6个亚组，每组8只。SE组、LL组和LH组大鼠腹腔内注射氯化锂（127 mg/kg），20小时后腹腔注射匹鲁卡品（25mg/kg）诱导癫痫持续状态模型。SO组大鼠腹腔内仅注射氯化锂（127 mg/kg）。其中，LL组和LH组大鼠于癫痫持续状态后15min分别灌胃左乙拉西坦口服液100mg/kg/d、300mg/kg/d，每日一次，连续应用两天。SO组和TBI组分别灌胃等量的生理盐水。
　　在相应时间点，各组动物腹腔注射10%水合氯醛(0.3g/Kg)麻醉后，以4%多聚甲醛心脏灌注，断头开颅取双侧海马组织。右侧海马组织分为两部分，一部分置于液氮中﹣80℃冰箱保存，用于western blot analysis和real time polymerase chain reaction(RT-PCR)，另一部分用于脑水肿测量。左侧海马组织也分为两部分，分别用于HE染色和透射电镜观察。
　　结果：
　　1.组织学和超微结构观察
　　SO组：癫痫持续状态后2h-12h神经元周围间隙增宽，细胞水肿呈气球样变，并逐渐加重。癫痫持续状态后24h神经元水肿达顶峰，表现为空泡细胞。水肿持续到3d，较24h有所缓解，开始出现胶质细胞增生和炎性细胞浸润。癫痫持续状态后7d细胞水肿基本消退。与SO组相比，LL和LH组在各个时间点细胞水肿均减轻，表现为气球样变的细胞数量明显减少和细胞周围间隙缩小。与LL组相比，LH组在12h、24h、3d时间点神经细胞水肿均减轻。SE组大鼠投射电镜超微结构可见海马区神经元细胞中线粒体水肿，线粒体嵴排列紊乱或断裂。与SE组相比，LL和LH组在各个时间点线粒体水肿均减轻。与LL组相比，LH组在12h、24h、3d时间点线粒体水肿均减轻。
　　2.大鼠海马区脑含水量测定
　　与SE组相比，LL和LH组脑含水量2h时明显低于SE(75.76±1.12，75.03±1.53，74.55±0.83)，差异具有统计学意义(P<0.05)，LL和LH组间比较无统计学意义(P>0.05)；LL和LH组脑含水量6h时也明显低于SE组(79.77±1.12，76.83±1.67，74.88±2.43)，差异具有统计学意义(P<0.05)，LL和LH组间比较无统计学意义(P>0.05)；12h时三组脑含水量继续增高（81.62±1.39a，77.70±1.56，75.69±2.00），三组间比较均有统计学意义(P<0.05)；24h时脑水含量均达最高(82.41±1.66，78.49±1.59，75.94±1.47)，且三组间比较均有统计学意义(P<0.05)；3d开始均下降(81.41±1.41，77.40±1.70，75.47±1.33)，三组间比较仍有统计学意义；7d时明显降低(77.80±0.75，75.51±2.37，74.81±0.78), LL和LH组仍稍高于SE组，差异有统计学意义(P<0.05)，但LL和LH组组间比较，无统计学差异(P>0.05)。
　　3.Western Blot测定海马区AQP4的表达
　　AQP4表达：与SO组相比，SE组、LL和LH组AQP4表达均呈上升趋势，差别有统计学意义(P<0.05)。LL和LH组各时间点均低于SE组，以12h、24h、3d降低明显，差别有统计学意义(P<0.05)。与LL组相比， LH组除2h、6h和7d，其余时间点均降低，组间差别有统计学意义(P<0.05)。
　　4.RT-PCR检测海马区AQP4 mRNA的表达
　　AQP4 mRNA表达：SE组、LL和LH组AQP4 mRNA表达均高于SO组，差别有统计学意义(P<0.05)。与SE组相比，LL和LH组在各时间点均低降低，均有统计学意义(P<0.05)。LL和LH组除2h、6h和7d，其余各时间点组间差别均有统计学意义(P<0.05)。
　　5.AQP4的表达和脑水肿的关系
　　在同一时间点，随着脑组织 AQP4的表达增高，脑组织含水量相应的升高。直线相关性分析显示：SE组、LL组和LH组AQP4蛋白，脑组织含水量，AQP4mRNA表达之间呈明显正相关(P<0.05)。
　　结论：
　　1.癫痫持续状态后，左乙拉西坦抑制AQP4蛋白及AQP4mRNA的表达与左乙拉西坦降低水肿脑组织含水量的趋势基本一致。
　　2.左乙拉西坦能够通过下调AQP4表达来减轻癫痫持续状态后海马区脑水肿，其神经保护作用在一定范围内存在着量-效关系。
　　第三部分：左乙拉西坦治疗治疗癫痫持续状态及海马电刺激治疗顽固性颞叶癫痫的临床疗效观察
　　目的：探讨左乙拉西坦治疗癫痫持续状态及海马电刺激治疗顽固性颞叶癫痫的疗效。
　　方法：将78例癫痫持续状态患者随机分为常规治疗组和联合治疗组。常规治疗组39例患者单独接受丙戊酸钠注射液治疗，联合治疗组39例患者应用丙戊酸钠注射液的同时联合鼻饲左乙拉西坦片。回顾性分析了河北省人民医院功能神经外科利用海马电刺激治疗顽固性颞叶癫痫患者。
　　结果：常规治疗组的总体有效率为61.5%，而联合治疗组的总体有效率为87.2%，差异具有统计学意义。海马电刺激使癫痫发作总体减少93%。
　　结论：左乙拉西坦联合丙戊酸钠治疗癫痫持续状态有效。海马电刺激治疗顽固性颞叶癫痫有效。

目录

声明

英文缩写

引言

第一部分大鼠癫痫持续状态后海马区脑水肿及海马区水通道蛋白4的表达及水通道蛋白4与脑水肿的关系

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第二部分左乙拉西坦对大鼠癫痫持续状态后海马区脑水肿及海马区水通道蛋白4表达的影响

前言

材料与方法

结果

附图

附表

讨论

小结

参考文献

第三部分左乙拉西坦治疗治疗癫痫持续状态及海马电刺激治疗顽固性颞叶癫痫的临床疗效观察

前言

材料与方法

结果

讨论

小结

参考文献

结论

综述一:水通道蛋白4与中枢神经系统疾病

综述二:脑水肿和水通道蛋白4的表达与调控

致谢

个人简历